E盒结合锌指蛋白2促进肺腺癌细胞A549迁移的作用研究

江守伟，王东升

肺癌是全球发病率和死亡率都较高的恶性肿瘤，转移是肺癌临床治疗失败的主要原因，因此，更加深入的理解肺癌发生转移的分子机制对其临床治疗具有至关重要的意义。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）指在特定的生理病理条件下，上皮细胞失去细胞极性，获得间质表型，细胞之间的黏连减弱，细胞与基底膜之间的桥梁破坏，转移能力明显提升的一种生物学过程。EMT最早发现于胚胎发育阶段，在创伤修复、组织重构过程中也发挥重要作用，最近的研究发现，EMT也参与了肿瘤发生发展的过程，肿瘤细胞通过EMT转化转移到新的部位，形成转移灶，因此，EMT被认为是肿瘤细胞发生转移的重要初始步骤。在EMT转化过程中，肿瘤细胞的上皮型表型逐渐消失，细胞形态变得梭长，更适合游走，细胞之间以及细胞与基底膜之间连接减弱，运动能力增强。E-钙黏素（E-cadherin）是上皮型细胞的标志物，E-cadherin表达减少是EMT转化的重要分子标志。

一系列转录因子参与了EMT转化过程的调控，包括锌指转录因子Snail、Snai2（Slug）、转录因子E盒结合锌指蛋白1（ZEB1）等，研究报道，这些转录因子可通过直接结合E-cadherin启动子上的E-box序列（CANNTG，N指随意碱基），抑制其转录，从而减弱其表达，促进EMT转化的发生。ZEB2是ZEB转录因子家族成员，研究报道ZEB2在多种肿瘤中处于高表达状态，包括结直肠癌、前列腺癌和胰腺癌等。越来越多的证据显示ZEB2涉及肿瘤的发生发展过程。最近的研究发现ZEB2可促进肝癌和肾癌细胞发生EMT转化，提高它们的转移能力。然而，ZEB2和肺癌转移之间的关系及机制并不明确。2018年3月至2019年5月为此进行了本研究，我们的研究为肺癌转移提供了一些重要的分子标靶和实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人非小细胞肺腺癌A549细胞株购自中科院上海细胞库。使用RPMI1640+10%胎牛血清的培养基在5%二氧化碳、37℃的培养箱中培养。

1.2 主要试剂

抗体ZEB2、E-cadherin和β-actin购自Santa Cruz公司，引物购自上海捷瑞生物工程公司，荧光定量PCR逆转录试剂盒和SYBR试剂购自TAKALA公司。

1.3 蛋白质印迹检测

A549细胞经相应的处理后，弃培养基，用4℃预冷的PBS轻轻洗涤细胞表面2次，加入预冷的Western blotting及IP裂解液，在冰面上充分裂解20 min，将细胞全部刮下转移到1.5 mL EP管中，4℃离心机内12 000 r/min离心30 min，收集上清至新的EP管。用BCA法测定每个样品的蛋白浓度，每个样本上样30μg蛋白加入到8%SDSPAGE胶中，电泳分离后，电转至PVDF膜（0.45 mm）上，PBS清洗PVDF膜1次，转移到5%脱脂奶粉配制的封闭液中室温孵育2 h，ZEB2、E-cadherin和β-actin抗体均以1∶1 000比例稀释后4℃孵育过夜，PBST洗涤PVDF膜3次后，以1∶5 000加入特异性二抗室温孵育1.5 h，PBST洗涤3次，加入ECL发光液在Western blotting曝光仪上曝光并拍照。

1.4 RT-PCR实验

样本经相应的处理后，加入1 mL Trizol试剂，按照提取流程，提取细胞中的总RNA，按照逆转录试剂盒要求，37℃15 min，85℃5 s将其逆转录为单链DNA（cDNA），以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内参进行实时定量PCR检测。检测过程中所使用的引物序列如下：ZEB2，正向引物5’-AAG GAG CAG GTA ATC GCA AG-3’，反向引物5’-GGA ACCAGA ATGGGA GAA ACG-3’；Ecadherin，正向引物5’-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3’，反向引物5’-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3’；GAPDH，正 向 引 物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。PCR反应条件：95℃预变性32 s，95℃5 s，60℃32 s，72℃30 s，共45个循环。根据2法计算每个基因的相对表达量。

1.5 免疫组化实验

肺癌病人癌组织样本和癌旁组织样本制备成切片后，烤片15 min，用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ20 min，100%乙醇Ⅰ10 min，100%乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min。3%双氧水37℃孵育10 min，PBS轻轻冲洗3次。在0.01 M柠檬酸钠缓冲液中煮沸20 min，自然冷却20 min至室温进行抗原修复，PBS轻轻冲洗3次，10%山羊血清工作液37℃封闭30 min，倾去封闭液，加入ZEB2抗体（1∶200）4℃过夜，PBS轻轻冲洗3次，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS轻轻冲洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS轻轻冲洗3次，DAB/HO反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片，显微镜拍照。肿瘤细胞胞质、胞核呈褐色为阳性。对染色强度进行评分，并将其分为4类：无（0）、弱棕色（1+）、中度棕色（2+）和强棕色（3+）。染色的范围分为5类：0为阴性细胞，1为1%～25%，2为25%～50%，3为50%～75%，4为＞75%。使用强度和范围的乘法（染色指数）来衡量蛋白的表达情况。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

2 结果

2.1 过表达ZEB2促进A549细胞迁移能力

A549细胞分别转染ZEB2质粒和空载质粒（转染空载质粒作为对照组），分别进行了RT-PCR和western blotting实验。RT-PCR结果显示，对照组细胞中ZEB2基因表达量为（1.0±0.01），转染ZEB2质粒组细胞中ZEB2基因表达量为（8.45±0.04），差异有统计学意义（

P

=0.0032）。Western blotting实验结果显示，与对照组相比，转染ZEB2质粒组细胞中ZEB2蛋白的表达明显增高（图1A）。将两组细胞分别进行Transwell迁移实验，结果显示，与对照组细胞相比，过表达ZEB2可明显提高A549细胞的迁移能力（图1B），对照组穿过Transwell小室的细胞数量为（48.3±4.2）个，过表达ZEB2组为（129.6±12.1）个，差异有统计学意义（

P

=0.0021）。

图1 过表达ZEB2促进A549细胞迁移能力：A为转染ZEB2过表达质粒后ZEB2蛋白表达变化情况；B为过表达ZEB2后A549细胞迁移能力的变化

2.2 干扰ZEB2抑制A549细胞迁移能力

A549细胞分别转染ZEB2基因干扰RNA和阴性干扰RNA（转染阴性干扰RNA作为对照组），分别进行RTPCR和western blotting实验。RT-PCR结果显示，对照组细胞中ZEB2基因表达量为（1.0±0.04），转染ZEB2干扰组细胞中ZEB2基因表达量为（0.23±0.08），差异有统计学意义（

P

=0.0027）。Western blotting结果显示，与对照组相比，转染ZEB2基因干扰RNA组细胞中ZEB2蛋白的表达明显降低（图2 A）。将两组细胞分别进行Transwell迁移实验，结果显示，与对照组细胞相比，干扰ZEB2可明显降低A549细胞的迁移能力（图2 B），对照组穿过Transwell小室的细胞数量为（37.6±8.1）个，干扰ZEB2组为（12.3±3.2）个，差异有统计学意义（

P

=0.0014）。

图2 干扰ZEB2降低A549细胞迁移能力：A为转染ZEB2干扰RNA后ZEB2蛋白表达变化情况；B为干扰ZEB2后A549细胞迁移能力的变化

2.3 ZEB2抑制E-cadherin的表达

A549细胞分别转染ZEB2质粒和空载质粒，ZEB2基因干扰RNA和阴性干扰RNA，进行了RT-PCR和Western blotting实验。PT-PCR结果显示，过表达ZEB2可降低Ecadherin基因的表达，过表达空载质粒组细胞中E-cadherin基因表达量为（1.0±0.01），过表达ZEB2组细胞中E-cadherin基因表达量为（0.51±0.07），差异有统计学意义（

P

=0.0015）；干扰ZEB2可促进E-cadherin基因的表达，干扰阴性对照组细胞中E-cadherin基因表达量为（1.0±0.02），干扰ZEB2组细胞中E-cadherin基因表达量为（2.32±0.04），差异有统计学意义（

P

=0.0011）。Western blotting结果显示，与对照组相比，过表达ZEB2可降低E-cadherin蛋白的表达，干扰ZEB2可促进E-cadherin蛋白的表达，见图3。

图3 ZEB2对A549细胞中E-cadherin蛋白表达的影响

2.4 ZEB2和E-cadherin在肺癌组织中的表达

免疫组织化学染色检测了30对肺癌病人的癌组织和癌旁组织样本中ZEB2和E-cadherin蛋白的表达情况。结果显示，癌组织中ZEB2蛋白表达明显高于癌旁组织，两组差异有统计学意义。E-cadherin蛋白在癌组织中的表达显著低于相对应的癌旁组织，两组差异有统计学意义。见图4。

图4 转录因子E盒结合锌指蛋白2载体（ZEB2）和E-钙黏素（E-cadherin）在肺癌组织中的表达情况：A为免疫组织化学染色图；B为表达情况

3 讨论

肺癌是全球范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，肿瘤转移是限制肺癌临床治疗效果的主要因素，更好地了解肺癌转移的潜在分子机制，对于肺癌治疗来说具有重大意义。最近的研究发现，上皮间质转化EMT在肺癌细胞转移过程中发挥了重要作用。上皮型肿瘤细胞获得间质表型后，细胞形态发生改变，增强了肿瘤细胞侵袭周边基质以及通过血液和淋巴系统转移到远端组织的能力。伴随着这种转化过程，肿瘤细胞之间的黏附能力减弱，对抗化疗放疗的能力增强，免疫逃逸能力增强，并获得了肿瘤干细胞样特性。EMT转化涉及多种肿瘤细胞，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌及前列腺癌等。在肺癌组织中发现多种EMT转录因子高表达，并且过表达EMT转录因子Snail、Twist、ZEB1可促进肺癌细胞的侵袭转移能力。在本研究中，我们发现过表达EMT转录因子ZEB2可促进肺腺癌细胞A549的迁移能力，而敲除ZEB2则减弱了A549细胞的迁移能力。

ZEB2是ZEB转录因子家族成员，在多种恶性肿瘤发生发展过程中展示了重要作用。抑制ZEB2表达可阻滞多种肿瘤的进展，例如，ZEB2可促进结直肠癌细胞的转移并与结直肠癌病人的预后密切相关；在肝癌细胞中，ZEB2可促进肿瘤的增殖和转移过程；在胃癌细胞中，ZEB2可促进肿瘤细胞对顺铂的耐受性；最近的一项研究表明，ZEB2在喉部鳞状细胞癌中发挥了原癌基因的作用，抑制其表达后可逆转肿瘤细胞EMT转化，降低细胞转移能力，并促进肿瘤细胞凋亡。然而，在肺癌中ZEB2的作用机制并不是非常清楚，本研究中我们发现过表达ZEB2可抑制EMT标志物E-cadherin的表达，促进肺腺癌细胞发生EMT转化，提高其迁移能力，而干扰ZEB2表达则发挥相反的作用，促进了E-cadherin的表达，逆转了EMT转化，降低了肺腺癌细胞的迁移能力。临床上，EMT和肺癌临床预后的关系并不明确。非小细胞肺癌中，EMT被报道与肿瘤耐药、干细胞特性以及预后存在相关性；也有文献提出相反意见，认为E-cadherin向N-cadherin表达转化和非小细胞病人预后并没有相关性。最新的研究发现非小细胞肺癌的前缘部位EGFR和EMT信号出现高表达与肿瘤预后密切相关。在本研究中我们发现，ZEB2蛋白在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织。除了侵袭转移，EMT参与了多种肿瘤进展的重要过程，如肿瘤干细胞特性、放化疗耐药、免疫逃逸等，在接下来的研究中，有必要进一步的探讨ZEB2与这些肿瘤恶性分子事件的关系及其中的分子机制。

总结来说，我们发现了过表达EMT转录因子ZEB2可促进肺腺癌细胞发生EMT转化，提高其迁移能力，而抑制ZEB2表达则出现了相反的现象。ZEB2在肺癌组织中的表达比癌旁组织明显增高。我们的研究提示抑制ZEB2可能成为肺癌临床治疗的作用靶点。