咪唑安定通过调控miR-4458/NF-κB通路影响结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

刘爱芬 王辉 王晓鹏天津医科大学第二医院麻醉科 00；天津市公安医院外一科 0004；山西白求恩医院麻醉科，太原 000

世界卫生组织最新癌症统计数据显示，每年全球结肠癌死亡病例高达86万例，已成为全球第3大常见恶性肿瘤［1］。手术切除是结肠癌最有效的治疗手段，然而越来越多临床或基础研究表明围术期麻醉技术对残留肿瘤细胞存活和转移的影响是导致癌症复发或术后转移的重要因素［2］。因此，寻找有效的抗癌麻醉药对改善结肠癌患者预后、提高生存率具有重要意义。咪达唑仑是一种广泛使用的苯二氮卓类麻醉剂，具有麻醉前给药、诱导和维持麻醉、治疗失眠和癫痫、重症监护室镇静等多种用途。近年来研究发现，咪唑安定对肝癌、咽鳞癌细胞具有显著细胞毒性作用［3-4］。咪 唑 安 定 通 过 上 调 微 小RNA（microRNA，miR）-137表达还可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡［5］。有报道指出，咪达唑仑可激活线粒体凋亡途径，诱导结肠癌细胞凋亡，抑制异种移植瘤生长［6］。miR-4458是一种新的抑癌基因，结肠癌中miR-4458下调，过表达miR-4458可抑制癌细胞增殖、糖酵解和乳酸生成［7］。有研究指出，异丙酚通过上调miR-4458表达对肝细胞进展具有抑制作用［8］。然而，咪达唑仑对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响，其机制是否与调控miR-4458表达相关并不清楚。本研究于2019年12月至2020年10月开展实验，通过体外实验分析咪唑安定对结肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭以及miR-4458表达的影响，并进一步揭示其潜在机制。

1 资料与方法

1.1 细胞和试剂 人结肠癌细胞SW620购于中国典型培养物保藏中心；咪唑安定（纯度为98%）购于中国上海士锋生物公司；miR-4458抑制物（anti-miR-4458）及其阴性对照（anti-miR-NC）由中国广州锐博公司合成；miR检测试剂盒购于美国Gene Copoeia公司；Transwell小室购于中国南京迅贝生物科技有限公司；核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt，PDTC）、噻唑蓝（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）试剂盒、兔源细胞周期 素D1（CyclinD1）、基 质 金 属 蛋 白 酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9多克隆抗体购于中国北京百奥莱博公司；兔源磷酸化的核因子κB p65（phosphorylated nuclear factor kappa Bp65，p-p65）抗体、β激动蛋白（beta-actin，β-actin）单克隆抗体、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗购于美国CST公司；鼠源磷酸化的NF-κB抑制蛋白（phosphorylated inhibitor of NF-κB，p-IкBα）单克隆抗体购于美国SCBT公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、处理和分组 SW620细胞用含有20.0%胎牛血清的杜尔伯格伊戈尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）置于37℃恒温、5.0%CO2培养箱中培养。为检测咪唑安定对SW620细胞生物学行为的影响，分别用含0、25、50、100μM咪唑安定［3］的培养液孵育SW620细胞48 h，依次记为0μM咪唑安定组、25μM咪唑安定组、50μM咪唑安定组、100μM咪唑安定组。为证实咪唑安定的抗肿瘤作用与调控miR-4458表达有关，利用脂质体转染法分别将anti-miR-4458、anti-miR-NC转染SW620细胞。将转染anti-miR-4458、anti-miR-NC后48 h的SW620细胞分别记为anti-miR-4458组、anti-miR-NC组。用含100μM咪唑安定培养液孵育转染细胞48 h，分为anti-miR-4458+100μM咪唑安定组、anti-miR-NC+100μM咪唑安定组。为证实NF-κB通路的作用，用终浓度为20 pmol/L的PDTC［9］和100μM咪唑安定干预转染anti-miR-4458细胞48 h，记为PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定组。按照下述具体步骤检测miR-4458表达以及细胞增殖、迁移、侵袭能力。

1.2.2 实时定量聚合酶链反应检测miR-4458表达使用miR提取试剂盒从上述各组细胞中分离miR，采用miR检测试剂盒进行逆转录和定量检测。miR-4458正向引物5'-AGAGGTAGGTGTGGAAGAA-3'， 反 向 引 物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3；U6正 向 引 物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'， 反 向 引 物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。2-△△Ct方 法 分 析SW620细胞中miR-4458表达水平。

1.2.3 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法检测细胞活力 每组取5×103个SW620细胞接种到96孔板，向各孔内加入20μl MTT工作液孵育细胞2 h，然后每孔添加150μl二甲基亚砜反应2 h，震荡10 min至结晶溶液。用分光光度仪在570 nm处测定各孔的吸光度（A值）以表示细胞增殖活力。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 每组取1×105个SW620细胞接种于涂有（侵袭测定）或未涂有（迁移测定）基质凝胶的上腔室中，培养基为200μl无血清培养基。下腔室中为600μl含10.0%胎牛血清的培养基。培养24 h后，采用4.0%多聚甲醛固定膜下表面细胞，0.2%结晶紫染色。用倒置显微镜观察200×镜下细胞，以随机5个视野细胞数的均值表示细胞迁移或侵袭能力。

1.2.5 蛋白质印迹法检测CyclinD1、MMP2、MMP9、p-p65和p-IкBα蛋白表达 用RIPA裂解液从不同组SW620细胞中提取总蛋白。用10.0%SDS-PAGE分离30μg蛋白样品，并湿法转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜封闭后，将 膜 与CyclinD1（1∶300）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶300）、p-p65（1∶1 000）、p-IкBα（200μg/ml）、β-actin抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜。然后，用羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。用增强化学发光系统对X线片进行显影、定影。凝胶图象处理系统分析目的条带的净灰度值（β-actin为内参）。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0.0进行统计分析。符合正态分布的实验数据采用均数±标准差（）表示。用单因素方差分析和LSD-t检验评估多组间差异；用独立样本t检验评估两组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度咪唑安定对SW620细胞增殖、CyclinD1的抑制作用 与0μM咪唑安定组比较，25μM咪唑安定组、50μM咪唑安定组、100μM咪唑安定组SW620细胞增殖活力、CyclinD1蛋白表达量显著降低（均P＜0.05）。随着咪唑安定浓度的增加，其对SW620细胞增殖活力、CyclinD1蛋白表达的抑制作用逐渐增强。见图1和表1。

表1 不同浓度咪唑安定对SW620细胞增殖、细胞周期素D1的抑制作用（n=9）

表1 不同浓度咪唑安定对SW620细胞增殖、细胞周期素D1的抑制作用（n=9）

注：与0μM咪唑安定组比较，a P＜0.05

组别0μM咪唑安定组25μM咪唑安定组50μM咪唑安定组100μM咪唑安定组F值P值A值1.089±0.07 0.843±0.05a 0.611±0.04a 0.527±0.03a 231.994＜0.001细胞周期素D1 0.83±0.07 0.70±0.05a 0.51±0.03a 0.44±0.03a 123.913＜0.001

图1 蛋白质印迹法检测CyclinD1蛋白相对表达量

2.2 不同浓度咪唑安定对SW620细胞迁移和侵袭能力、MMP2、MMP9的抑制作用 与0μM咪唑安定组比较，25μM咪唑安定组、50μM咪唑安定组、100μM咪唑安定组SW620细胞迁移和侵袭数量、MMP2和MMP9蛋白表达量显著降低（均P＜0.05）。随着咪唑安定浓度的增加，其对SW620细胞迁移、侵袭、MMP2和MMP9蛋白表达的抑制作用逐渐增强。见图2和表2。

表2 不同浓度咪唑安定对SW620细胞迁移和侵袭的、MMP2、MMP9抑制作用（n=9，）

表2 不同浓度咪唑安定对SW620细胞迁移和侵袭的、MMP2、MMP9抑制作用（n=9，）

注：与0μM咪唑安定组比较，a P＜0.05；MMP2为基质金属蛋白酶2，MMP9基质金属蛋白酶

组别0μM咪唑安定组25μM咪唑安定组50μM咪唑安定组100μM咪唑安定组F值P值细胞迁移数量179±13.07 147±10.49a 117±8.06a 83±6.13a 158.339＜0.001细胞侵袭数量136±9.14 113±8.67a 89±4.71a 61±3.79a 190.933＜0.001 MMP2 0.91±0.07 0.73±0.05a 0.56±0.04a 0.45±0.03a 147.242＜0.001 MMP9 0.76±0.06 0.58±0.04a 0.41±0.03a 0.34±0.02a 195.092＜0.001

图2 蛋白质印迹法检测MMP2、MMP9蛋白相对表达量

2.3 不同浓度咪唑安定对miR-4458、p-p65、p-IкBα表达的影响 与0μM咪唑安定组比较，25μM咪唑安定组、50μM咪唑安定组、100μM咪唑安定组SW620细胞miR-4458表达量显著升高（均P＜0.05），p-p65和p-IкBα蛋白表达量显著降低（均P＜0.05）。随着咪唑安定浓度的增加，其对SW620细胞miR-4458、p-p65和p-IкBα蛋白表达的抑制作用逐渐增强。见图3和表3。

图3 蛋白质印迹法检测p-p65、p-IкBα蛋白相对表达

表3 不同浓度咪唑安定对miR-4458、p-p65、p-IкBα表达的影响（n=9，）

表3 不同浓度咪唑安定对miR-4458、p-p65、p-IкBα表达的影响（n=9，）

注：与0μM咪唑安定组比较，a P＜0.05；p-p65为核因子κB p65，p-IкBα为NF-κB抑制蛋白

组别0μM咪唑安定组25μM咪唑安定组50μM咪唑安定组100μM咪唑安定组F值P值miR-4458 1.00±0.08 1.43±0.10a 1.89±0.15a 2.01±0.14a 131.256＜0.001 p-p65 0.83±0.07 0.70±0.05a 0.57±0.04a 0.43±0.03a 107.242＜0.001 p-IкBα 0.71±0.05 0.61±0.04a 0.48±0.04a 0.37±0.02a 130.377＜0.001

2.4 抑制miR-4458表达可以减轻咪唑安定对结肠癌细胞miR-4458、增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2、MMP9的影响 与anti-miR-NC组比较，anti-miR-4458组SW620细胞增殖活力、迁移和侵袭数量、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达量显著升高（均P＜0.05）；与anti-miR-NC+100μM咪唑安定组比较，anti-miR-4458+100μM咪唑安定组SW620细胞增殖活力、迁移和侵袭数量、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达量显著升高（均P＜0.05）。见图4和表4。

表4 抑制miR-4458表达可以逆转咪唑安定对结肠癌细胞miR-4458、增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2、MMP9的影响（n=9）

表4 抑制miR-4458表达可以逆转咪唑安定对结肠癌细胞miR-4458、增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2、MMP9的影响（n=9）

注：与anti-miR-NC组比较，aP＜0.05；与anti-miR-NC+100μM咪唑安定组比较，bP＜0.05；CyclinD1为细胞周期素D1，MMP2为基质金属蛋白酶2，MMP9为基质金属蛋白酶9

组别anti-miR-NC组anti-miR-4458组anti-miR-NC+100μM咪唑安定组anti-miR-4458+100μM咪唑安定组F值P值miR-4458 1.00±0.08 0.48±0.03a 1.98±0.13 1.21±0.09b 431.954＜0.001 A值1.093±0.08 1.428±0.11a 0.534±0.04 0.978±0.07b 196.416＜0.001细胞迁移数量183±14.55 237±19.76a 87±5.73 173±9.84b 189.490＜0.001细胞侵袭数量131±8.14 179±14.12a 65±4.13 143±11.04b 201.546＜0.001 CyclinD1 0.85±0.06 1.37±0.11a 0.43±0.02 0.81±0.06b 272.589＜0.001 MMP2 0.93±0.08 1.58±0.12a 0.48±0.03 0.89±0.08b 264.854＜0.001 MMP9 0.77±0.06 1.11±0.09a 0.36±0.02 0.75±0.05b 231.842＜0.001

图4 蛋白质印迹法检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表达

2.5 NF-κB抑制剂PDTC可逆转抑制miR-4458对咪唑安定处理的SW620细胞p-p65、p-IкBα、增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2和MMP9的影响 与anti-miR-4458+100μM咪唑安定组比较，PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定组SW620细胞p-p65、p-IкBα、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达量显著降低（均P＜0.05），细胞增殖活力、迁移和侵袭数量显著降低（均P＜0.05）。见图5和表5。

表5 PDTC可以逆转miR-4458下调对咪唑安定处理的SW620细胞p-p65、p-IкBα、增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2、MMP9的影响（n=9）

表5 PDTC可以逆转miR-4458下调对咪唑安定处理的SW620细胞p-p65、p-IкBα、增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2、MMP9的影响（n=9）

注：p-p65为核因子κB p65，p-IкBα为NF-κB抑制蛋白，CyclinD1为细胞周期素D1，MMP2为基质金属蛋白酶2，MMP9为基质金属蛋白酶9

组别anti-miR-4458+100μM咪唑安定组PDTC+anti-miR-4458+100μM咪唑安定组t值P值p-p65 0.91±0.07 0.48±0.03 16.939＜0.001 p-IкBα 0.73±0.05 0.34±0.04 18.272＜0.001 A值0.978±0.07 0.547±0.03 16.978＜0.001细胞迁移数量173±9.84 76±4.19 27.209＜0.001细胞侵袭数量143±11.04 61±4.05 20.919＜0.001 CyclinD1 0.81±0.06 0.43±0.03 16.994＜0.001 MMP2 0.89±0.08 0.46±0.03 15.098＜0.001 MMP9 0.75±0.05 0.39±0.02 20.055＜0.001

图5 蛋 白 质 印 迹 法 检 测p-p65、p-IкBα、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表达

3 讨 论

近年来研究表明，麻醉可能会影响患者代谢，加剧围术期免疫抑制和炎症，与癌细胞转移、扩散以及肿瘤复发相关［2］。本研究探讨了咪唑安定对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响，结果显示咪唑安定可降低SW620细胞增殖活力，下调促增殖蛋白CyclinD1表达，与窦云凌等［10］报道的抗增殖作用相吻合。结肠癌的侵袭和转移是一个复杂、连续的多步骤过程，其中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解是肿瘤转移的重要事件［11］。MMP2和MMP9是MMP蛋白家族成员，可降解胶原蛋白和ECM各种成分，MMP2和MMP9表达改变与结肠癌转移密切相关［12］。本研究表明，咪唑安定处理可下调MMP2和MMP9表达，降低SW620细胞迁移和侵袭能力。此外，本研究发现，咪唑安定浓度越高，其对SW620细胞增殖、迁移和侵袭以及CyclinD1、MMP2和MMP9表达抑制作用越强，这表明咪唑安定对结肠癌细胞恶性生物学行为具有抑制作用。与此发现一致，洪金全等［13］证实，咪唑安定以剂量依赖方式抑制套细胞淋巴瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡。

miR作为基因表达的关键调节因子，可影响肿瘤发生和进展。研究表明，miR-4458在乳腺癌组织、细胞中表达显著降低，miR-4458下调增强了乳腺癌细胞的增殖活力、迁移和侵袭能力［14］。miR-4458可抑制肺癌细胞迁移和上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）进程［15］。敲减细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B反义RNA1对骨肉瘤细胞增殖、迁移和EMT进展的抑制作用与诱导miR-4458表达有关［16］。本研究发现，咪唑安定可增加SW620细胞中miR-4458表达量，暗示咪唑安定的抗肿瘤作用可能与调控miR-4458表达有关。功能实验表明，转染anti-miR-4458抑制miR-4458表达可增加SW620细胞增殖活力、迁移和侵袭能力，上调CyclinD1、MMP2和MMP9表达，并逆转咪唑安定对SW620增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

NF-κB是一种普遍存在的核转录因子，由p50、p65和IκBα亚基组成，其激活参与细胞增殖、炎症、血管生成和转移，是结肠癌治疗的重要靶点［17］。有研究表明，姜黄素通过激活腺苷酸活化蛋白激酶和抑制NF-κB活化可抑制MMP9表达进而抑制结肠癌细胞侵袭［18］。姜黄素通过抑制NF-κB活化可逆转结肠癌细胞EMT进程和迁移［19］。此外，咪唑安定联合舒芬太尼通过抑制NF-κB的表达可抑制炎性反应，提高镇静、镇痛效果，减轻急性胰腺炎损伤［20］。本研究表明，咪唑安定处理可抑制p-p65、p-IкBα表达，抑制NF-κB活化。深入研究表明，使用PDTC抑制NF-κB显著减弱抑制miR-4458联合咪唑安定对SW620增殖、迁移和侵袭的影响，这说明miR-4458/NF-κB途径是咪唑安定在结肠癌中发挥抗肿瘤作用的重要途径。

总之，本研究证实，咪唑安定对结肠癌细胞增殖活力、迁移和侵袭能力具有抑制作用，其机制是通过上调miR-4458表达、抑制NF-κB活化实现的，这进一步揭示了咪唑安定的抗肿瘤机制，为咪唑安定用于防治结肠癌提供重要依据。

利益冲突：文章所有作者共同认可文章无相关利益冲突。