临床儿童感染肺炎支原体的临床分型以及CARDSTX基因的验证

麦荣嘉 黄研 马丹娟 邓文喻

广东省妇幼保健院，广州 510010

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是一种无细胞壁、形态呈高度多样性、能通过除菌滤器、能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。MP是呼吸道感染常见的病原体，全年均可致病，以秋冬季节发病为主，有一定流行趋势，不同地域、季节发病率不一，好发于儿童、青少年［1］。MP感染具有较高的发病率和临床意义，但仍是一种被低估的疾病［2］。为了更好地了解MP的流行状况，分子生物学分型是监测和调查的有效方法。目前，快速循环聚合酶链反应（rapid-cycle polymerase chain reaction polymerase chain reaction，Rapid-Cycle PCR）能快速、高效地对MP进行临床分型［3］。近年来，获得性呼吸窘迫综合征毒素（community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDSTX）的发现，为MP感染引发免疫损伤提供有力证据［4-5］。目前国内对MPCARDSTX罕有报道［6］，而CARDSTX基因序列的研究未见报道。因此，本研究拟检测本院2019年儿童急性呼吸道感染患者MP的感染率，并用Rapid-Cycle PCR对MP临床菌株进行P1基因分型，了解本地区MP的流行情况；同时运用PCR扩增CARDSTX基因，比对分析标准株M129型与临床株的CARDS基因序列，了解临床MP的CARDSTX基因序列保守性。

1 材料与方法

1.1 材料 实验保存的标准菌株M129型（ATCC29342）。支原体液体培养基CM403购自美国Invitrogen公司。

1.2 MP临床菌株的分离培养和DNA提取

1.2.1 临床MP的鉴定 本实验通过收集2019年本院临床诊断为急性呼吸道感染的住院患儿咽拭子标本165例，使用Real-time PCR鉴定MP临床菌株。使用达安基因公司的肺炎支原体核酸检测试剂盒DNA，严格按试剂说明书进行操作。

1.2.2 MP临床标本的处理以及培养［7］对于鉴定为MP阳性标本的前提下，收集相关患儿的痰液标本或者支气管灌洗液标本进行MP菌株培养分离。首先，在痰液标本加入终浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶，置37℃水浴作用30 min，中间不时摇动3～4次，见痰液标本明显液化即可，再加等量CM403肉汤培养液稀释培养。而对于支气管灌洗液标本，12 000转/min（离心半径为9.8 cm），离心10 min，倒去上清，取沉淀于3 ml CM403培养液中。再者，将上述样品置于37℃温箱培养6 h后，再用0.22μm滤膜针头式滤菌器滤除杂菌，然后将滤液用CM403肉汤培养液再补足至5 ml，于37℃、5%CO2温箱继续培养5～7 d，同时设置阴性对照，每日观察液体培养基颜色变化。若≥4 d时培养液颜色由红变黄且清亮不混浊，表明MP生长，阴性对照无颜色变化；另外取100μl菌液加入1 ml CM403肉汤培养液中继续培养得到MP纯种。使用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取试剂盒提取菌液的基因组DNA，严格按试剂说明书进行操作。

1.3 MP的临床分型 根据MPP1基因多态性和参考文献［8-9］合成Rapid-Cycle PCR法的扩增引物：P1-40、MPAW2；PnG1S、MPI-A2；PnG2S、PnG2A。引物序列和扩增片段大小见表1，合成Rapid-Cycle PCR法的扩增引物，行两轮PCR扩增。先用P1-40/MPAW2为外侧引物进行第一轮扩增。然后以扩增产物为模板，用内侧引物PnG1S/MPI-A2扩增P1-1型（607 bp）；PnG2S/PnG2A扩增P1-2型（265 bp）。PCR条件均参照文献［9］。

表1 Rapid-Cycle PCR法的引物序列

1.4 CARDSTX基因的验证、测序以及比对 根据MP全基因序列（MPN372）设计包含CARDSTX基因序列扩增片段，用软件Premier 5.0自行设计引物：CARDS-F和CARDS-R，序列长度2380bp（包含CARDS基因序列1760bp）。反应条件：94℃预变性10 min，98℃变性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸20 s，共34个循环；最后72℃10 min延伸，终止反应。随机选取5株MP临床株的CARDSTX基因扩增产物送至广州艾基生物公司进行测序，并将标准株M129型的CARDSTX基因序列（基因编码：DQ447750）与临床株测序结果分别进行比对。

2 结 果

2.1 鉴定临床MP标本 165例临床住院儿童急性呼吸道感染咽拭子标本中，其中31例（18.79%）荧光PCR信号阳性（＞5×102copies/ml），见图1。

图1 MP临床株的Rapid-Cycle PCR鉴定

2.2 MP菌株的分离培养 将处理后的MP临床标本接种于CM403液体培养基，培养结果见图2。MP生长过程中，利用葡萄糖并分解产生酸性代谢物质，使培养基pH发生改变，使酚红指示剂由红色变成橘黄色。最终分离培养获得临床MP分离株为25株，其中有6株没能分离成功。

图2 MP临床株在CM403液体培养基中的培养结果

2.3 MP菌株的Rapid-CyclePCR分型 以P1-40/MPAW2引物扩增的第1轮产物为模板，用PnG1S/MPI-A2扩增出607 bp的DNA片段为MPP1-1型。结果显示，25株MP临床株均扩增出607 bp条带，说明25株均为P1-1型菌株（图3）。25株临床株均未扩增出P1-2型265 bp条带。

图3 5株MP临床株Rapid-Cycle PCR分型的鉴定

2.4 MP菌株的CARDSTX基因扩增以及测序 用引物CARDS TX-F/R对25株临床株进行PCR，均扩增出2 380 bp目的片段（图4）。随机选取5株临床株的CARDS TX基因测序，并与genbank数据库的M129序列同源性达99.88%。

图4 5株MP临床株CARDSTX基因的鉴定

3 讨 论

MP作为婴幼儿、青少年呼吸道感染的主要病原体之一，感染后临床表现常无特异性，易于与其他病毒、细菌所致的呼吸道感染相混淆，且对抗生素敏感性具有特殊性，所以临床对于检测MP具有十分重要的意义［1-2，10］。目前，最常用MP分型主要根据P1基因重复序列的核酸差异为主要依据，分为P1-1型和P1-2型［11-12］。由于P1基因含有RepMP 4和RepMP 2/3两个重复序列易发生基因突变或重组，可导致表面膜蛋白P1氨基酸序列的改变而形成新亚型。根据报道，每隔3～7年MP可发生1次地域流行或爆发，这与MP的分型转换流行相关［8］。本试验从本院收集的165例急性呼吸道患者的咽拭子标本中共检出31例MP临床菌株，阳性率为18.79%。

目前，P1限制性片段长度多态性分析（RFLP）、多位点变量数串联重复分析（MLVA）、多位点序列分型方法、单核苷酸多态性、Rapid-Cycle PCR、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和全基因组测序分析都被用于MP的分型［13-14］。Rapid-Cycle PCR是MP分型最为实用的方法之一，并且操作简单，得到广泛应用。本试验通过Rapid-Cycle PCR获得25株P1-1型菌株，未检出P1-2型菌株。分离临床株在MP感染的致病性中，除了通过表面膜蛋白P1的变异、荚膜样物质的抗吞噬作用等逃避宿主免疫系统的防御外，CARDSTX的发现对于了解MP的致病有重要意义。目前发现CARDSTX是MP感染宿主细胞的主要毒性蛋白，在促发气道炎症及维持气道高压状态中扮演重要角色［4-5，12］。Kannan等［4］、Becker等［5］通过研究CARDSTX的编码基因及其功能，证实其毒素功能区和结构区与百日咳毒素蛋白S1相似；其毒素的二磷酸腺苷-转移酶N端残基就像百日咳毒素蛋白一样，保留烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合催化基团和催化谷氨酸残基。有研究发现，P1-2型菌株可以高表达CARDSTX，相比P1-1型菌株更具有侵袭性。然而本研究通过检测25株MP的临床分离P1-1型菌株，均携带CARDSTX基因序列；并根据测序结果，与数据库的M129同源性达99.88%，说明CARDSTX基因高度保守。而对于P1-1型菌株与P1-2型菌株CARDSTX表达差异，还需要进一步的研究。

综上所述，本研究收集地区临床MP感染菌株，通过Rapid-Cycle PCR分型，了解本地区MP流行主要以P1-1型为主。并且通过验证MP临床株的CARDSTX基因，发现其具有高度保守性，或许能成为MP感染的新靶标。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。