安石榴苷对绝经后大鼠骨性关节炎模型的作用及分子机制研究

王成，黄哲璟，王扬剑，余梦焙

骨性关节炎（OA）主要临床表现为 缓慢发展的关节疼痛、僵硬、肿大伴活动受限，严重者导致关节功能障碍甚至残疾，是老年人关节疼痛和致残的首要原因[1]。绝经后女性，OA的发病率明显偏高，雌激素水平下降可能是女性OA发病的重要风险因素[2]。目前西医主要以抗骨质疏松药联合非甾体类抗炎药、关节腔注射、功能锻炼、理疗等方式进行对症治疗。安石榴苷（Pun）的类雌激素样作用在动物实验研究方面已经得到证实[3]，对雌激素缺乏的骨质疏松症骨量丢失方面具有明显抑制作用，同时可以促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞活性[4]。本研究探讨Pun对去卵巢雌鼠OA模型的保护作用，以期为临床OA治疗提供相关参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物与试剂 5月龄健康雌性SD大鼠100只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养1周后称重，实验大鼠分笼饲养，自由活动，自然光照，自由饮食。饲养温度20～23℃，相对湿度为50%～55%。动物实验经宁波市第一医院实验动物管理委员会批准通过。安 石 榴 苷（Pun，百 灵 威，北 京，P840270），17 -雌二醇（阿拉丁，北京，E110147），Trizol试剂（索莱宝，北京，10296028），cDNA第一链合成试剂盒和2×Probe qPCR Mix试剂盒（杭州新景生物技术有限公司），MMP-1抗体（ER63978）、-actin抗体（EM21002）、TIMP-1抗体（EM2001-03）及MMP-3抗体（ER1706-77）均购自杭州华安生物技术有限公司，HRP偶联抗兔二抗（CST，美国，#7074），TIMP-1、MMP-3以及IL-1 ELISA检测试剂盒（CAT.No：70-EK3 1 3 8-2 4/7 0-a b 3 5 6 6 7-0 5 0/7 0-EK301BHS-96）均购自杭州联科生物科技有限公司，大鼠雌二醇（E2）（CAT.NO：ARG22693）/MMP-1 ELISA试剂盒（ARG21506）均购自Arigo公司，其他试剂包括乙醇和异丙醇等的分析等级购自中化试剂有限公司（上海，中国）。

1.2 动物模型构建 在麻醉下经背侧第三腰椎横突下方椎旁进入腹腔切除大鼠双侧卵巢，止血后逐层缝合。去卵巢一周后，每天进行阴道脱落细胞涂片和吉姆萨染色，连续5 d，以不出现动情期反应为去卵巢成功。在膝关节内侧靠近髌骨处切开皮肤及关节囊，将髌骨推向外侧，切断交叉韧带，切除内侧半月板，滴入少量青霉素溶液，缝合关节囊及皮肤，术后5 d内给予青霉素溶液10万U/d肌肉注射防感染。分笼饲养并驱赶4周加速OA发生，每周驱赶3次，每次＞60 min。挑选造模成功大鼠60只，随机分为6组，10只/组。分为伪手术组、模型组、阳性药组（皮下注射17-雌二醇50 g/d）、Pun低剂量组（PunLo，10 mg/kg）、Pun中剂量组（PunMed，20 mg/kg）及Pun高剂量组（PunHi，40 mg/kg）。Pun组每天灌胃给予不同剂量Pun溶液，实验持续16周。

1.3 大鼠足底加压痛阈测量 将大鼠放置于金属丝网垫上，用特制透明塑料笼罩住，待其适应30 min安静后，连接好张力测量仪器，通过小动物生物信号采集处理系统（卡尔文，南京，Medlab型）进行信息收集，对测试探针进行张力调零后，垂直作用于大鼠足底部，在大鼠缩足时记录电脑屏幕显示的探针施加压力的大小。造模前测量3次取平均值，造模之后分别在4、8、12及16周检测大鼠足部承重压力阈值，每只动物每次测试间隔时间不少于30 s。

1.4 骨密度检测 各组大鼠于灌胃12周后，每组取4个股骨标本，在OPX-L型双能X线骨密度测量仪（Lunar，USA，附动物骨密度测量软件）下扫描股骨远端，测量其骨密度值。每个标本测量2次，取平均值。

1.5 血清雌二醇（E2）浓度及子宫指数的测定 OA造模后的第4、8、12及16周分别取大鼠血样，离心分离后取血清，雌二醇ELISA试剂盒测定大鼠血清E2水平。实验结束时取子宫称重，计算子宫指数：子宫湿重（mg）/体质量（g）。

1.6 关节滑液中炎症因子检测 造模16周之后，大鼠脱颈椎处死后，立即自膝关节注入0.9%氯化钠注射液0.2 ml，混匀后抽取20 l关节液，使用磷酸盐缓冲液将抽取关节液稀释至1 ml，采用ELISA对稀释后的关节液进行白介素（IL）-1、基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-1蛋白定量分析，操作方法参见说明书。每个标本至少测定3次。

1.7 Western-Blot检测 软骨组织液氮研磨后加入RIPA细胞裂解液，提取组织蛋白，BCA法进行蛋白定量。蛋白样本按40 g/泳道上样，12%SDS-PAGE电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，用含有5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜。第2天用TBST洗涤后孵育二抗。TBST洗涤后加入ECL，蛋白成像仪获取图像。Image J计算条带光密度，以-actin带为内参，计算图中各目的蛋白带相对表达水平。

1.8 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用ANOVA单因素方差，组间比较采用t检验；相关性分析采用Pearson相关系数（r）进行评估。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pun对大鼠去卵巢OA模型痛阈、骨密度和子宫指数影响 正常雌性大鼠在5d的检测中有出现动情期，阴道分泌物中有核细胞占大多数，并可见上皮角化细胞。在去势模型组仅见大量白细胞，罕见有核细胞及上皮角化细胞。见封三彩图2。

图2 大鼠去卵巢后阴道分泌物染色及OA造模后足底痛阈测试注：A：大鼠动情期间应道分泌物镜下观察（HE，×200）；B：大鼠OA造模后足底痛阈检测波形图

使用高剂量Pun后，OA大鼠足底承重阈值的恢复情况能达到伪手术组和阳性药组的水平，模型大鼠足底承重阈值与Pun剂量正相关（r=0.9012，P＜0.05）；模型组BMD显著低于伪手术组，给予Pun以后可改善BMD，并与剂量呈正相关（r=0.7692，P＜0.05），高剂量组与阳性药物组比差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组子宫指数明显低于伪手术组（P＜0.05），给予Pun后可显著改善子宫指数（P＜0.05），并与剂量呈正相关（r=0.9009，P＜0.05）。见表1。

表1 Pun对OA大鼠痛阈、BMD和子宫指数的影响

2.2 Pun对去卵巢OA大鼠血清E2水平的影响 Pun显著提高E2浓度，并呈现剂量依赖性，见表2。

表2 各组雌二醇浓度 pg/ml

2.3 Pun对关节滑液中炎症因子影响模型组中IL-1分泌显著升高，PunHi组可显著减少炎症介质IL-1的表达（P＜0.01）。模型组中MMP-1、TIMP-1和MMP-3/TIMP-1的比值增加，PunHi组中比值显著降低（P＜0.05），接近阳性药组。见表3。

表3 炎性因子检测结果 pg/ml

模型组MMP-1、MMP-3的蛋白表达显著增加，而TIMP-1的表达显著下降。Pun组MMP-1、MMP-3表达均高于模型组（均P＜0.05）。见封三彩图3。

图3 Western blot检测大鼠MMP-1、MMP-3和TIMP-1表达

3 讨论

OA是老年人常见的关节疾病，尚缺乏有效的治疗方法，尤其是绝经后妇女，雌激素对软骨有明显的保护作用。大鼠双侧卵巢切除可模拟人绝经后的生理变化[5]。本研究在通过手术切除大鼠双侧卵巢基础上，切断关节交叉韧带，切除半月板，成功建立绝经后OA大鼠模型。结果显示大鼠造模后血清E2降低、Il-1上调。同时模型组大鼠在卵巢切除后4周即出现OA症状，表现为血清E2、子宫指数和骨密度下降，下肢关节痛阈下降等变化，与文献报道相符[6]。

Pun具有明确的抵抗炎症和氧化损伤效果，被越来越多地应用到抗衰老和心血管疾病、糖尿病和肿瘤的预防中[7]。研究显示，Pun具有类雌激素作用，在动物实验上被证实[8]。本研究结果发现Pun在与雌激素密切相关的OA关节软骨受损中发挥保护作用，且以剂量依赖的方式逐渐增加大鼠E2水平，并显著增加子宫指数和骨密度，高剂量组可达到与阳性药物相近效果。

在OA发病机制研究中，IL-1不仅可上调IL-6和其他促炎因子的表达，而且是调节软骨分解相关基因的关键细胞因子，IL-1上调可诱导破坏性基质金属蛋白酶（MMPs）表达加重OA进展[9]。本研究发现模型组大鼠血清E2含量降低而关节腔中IL-1分泌显著增加，Pun抑制IL-1的表达，可能是因为Pun给药后诱导血清E2升高继而降低炎症介质IL-1的表达[10]。在正常软骨中，MMPs和TIMP-1之间是平衡的，并在维持关节软骨的完整性方面起着重要的作用，MMPs/TIMP-1比值变化是反应OA进展的重要指标[11]。研究表明，不受控制的调节和加剧的MMPs表达参与了OA的发病[12]。本研究中模型组MMP-1、MMP-3的蛋白表达显著增加，并与OA严重程度呈正相关。相反，TIMP-1的表达则下调，最终使得模型组中MMP-1/TMP-1和MMP-3/TIMP-1的比值显著增加。Pun组MMP-1、MMP-3相对表达水平逐渐下调，并呈剂量依赖性。同时，Pun组TIMP-1蛋白水平略有升高。值得注意的是，高剂量Pun可以明显地增加这两个比值，这种影响类似于阳性药组。这表明Pun可以减少IL-1分泌，进而降低MMP-1/TIMP-1和MMP-3/TIMP-1在OA中的比值。

综上所述，本研究成功建立去卵巢OA大鼠模型，并证实Pun通过提高痛阈和骨密度、降低炎性因子水平及改变骨代谢平衡，明显缓解去卵巢大鼠OA症状，在绝经后OA治疗上具有一定前景。