应用流式细胞术检测急性髓系白血病微小残留病的临床研究

艾克拜尔·阿布都热衣木，阿孜古丽·麦麦提，阿依姆妮萨·阿卜杜热合曼，帕提古力·苏力坦，徐丽，吾拉木江·艾力 ，巴哈古丽·玉素甫

（1.喀什地区第一人民医院，新疆 喀什；2.喀什地区结核病防治所，新疆 喀什）

0 引言

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，各亚型有不同的形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学特征。目前化疗后完全缓解率（Complete Remission, CR）可达60%～80%，大部分成人AML患者在通过诱导缓解化疗获得形态学上确定的完全缓解（CR）后复发[1-2]。这说明目前的化疗方案还不能完全清除体内的白血病细胞，而这些化疗后残留的白血病 细 胞，即 微 小 残 留 病（Minimal Residual Disease, MRD），就是复发的根源[3-4]。来自欧洲白血病网络MRD工作组的共识文件[5]将微小残留病称为可测量的残留病（Measurable Residual Disease, MRD），认为它是急性髓系白血病（AML）的一个独立的、诊断后的预后指标，它与初诊时评估用的其它成熟的临床、细胞遗传学和分子生物学数据相结合，对风险分层和治疗计划非常重要。该工作组建议流式细胞术检测非常低水平的MRD（小于10-4）可以作为区分预后特别好的分界值，即免疫学水平缓解的标准。本研究选用AML各亚型白血病相关免疫表型中平均表达率较高的CD抗原构成一个特异性组合来检测急性髓系白血病MRD，试图研究应用流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）微小残留病（MRD）的有效方案及其意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病例

收集2018年1月至2020年6月在新疆喀什地区第一人民医院血液内科住院治疗的初诊AML患者共53例，其中男29例，女24例。年龄14～70岁，平均年龄34岁。M1为2例（3.8%），M2为31例（58.8%），M3为13例（24.5%），M4为5例（9.4%），M5为2例（3.8%）。

1.1.2 对照组

我们收集20例非再障良性贫血患者作为对照，其中男11名，女9名，平均年龄41岁，骨髓抗原平均表达率0.007%。

1.1.3 诊断及疗效标准

本研究收集的53例AML患者均参照2016年WHO造血与淋巴组织肿瘤分类MICM分型标准[6]确诊。对于复发难治组的诊断标准参照复发难治性急性髓系白血病中国诊疗指南（2017年版）[7]。

1.1.4 治疗方案

本研究化疗方案参照成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）[8]和中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南（2014年版）制定[9]。

1.2 研究方法

1.2.1 流式细胞术

应用流式细胞术检测免疫表型和微小残留病，我院 引 进 的 流 式 细 胞 仪（Flow Cytometer，FCM）是 国 产MINDREY® BriCyte™ 流式细胞仪，单克隆抗体由美国BD公司提供，本研究所选的CD抗体包括：CD7、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD56、CD64、CD117、MPO和 HLA-DR共12种，涵盖了AML各亚型平均表达率较高的特异性免疫标志。CD抗原表达阳性的判断标准：髓细胞膜抗原荧光阳性细胞＞20%，胞浆抗原和CD34、CD38则荧光阳性细胞＞10%[10-11]。

1.2.2 细胞形态学检查

骨髓涂片及血涂片用瑞氏染色分类计数，同时做细胞化学染色，包括过氧化物酶染色（POX）、非特异性酯酶+氟化钠抑制实验（NSE+NaF）、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）和糖原染色（PAS）。

1.2.3 统计学方法

研 究 资 料 用SPSS17.0（Statistical Package for Social Sciences）社会科学统计软件包进行统计处理，计量资料用率描述，用双侧检验，检验水准α=0.05。所有研究资料进行正态性检验和方差齐性检验（f检验），如果方差齐用t检验，如果方差不齐用t'检验。

2 结果

2.1 初诊时免疫表型特点

初诊时用流式细胞术检测53例AML抗原平均表达率23.97%，各亚型抗原平均表达率M1为14.6%，M2为24.2%，M3为23.3%，M4为30.9%，M5为17.1%。

2.2 诱导缓解化疗结束时免疫表型特点

53例AML患者诱导缓解化疗结束时根据骨髓细胞形态学分缓解（CR）组和未缓解（NR）组，CR组37例，NR组16例，缓解率69.81%。CR组抗原平均表达率12.84%，NR组抗原平均表达率20.71%。

2.3 持续化疗时免疫表型特点

53例AML在巩固化疗过程中4例行异基因造血干细胞移植，7例放弃治疗，未能继续随访。坚持巩固化疗的42例AML在化疗第6个月时根据骨髓细胞形态学分持续缓解（CCR）组和复发难治（RR）组，CCR组29例，RR组13例，持续缓解率69.1%。CCR组抗原平均表达率4.427%，RR缓解组抗原平均表达率16.32%。继续巩固化疗第12月时形态学持续缓解状态的29例AML根据流式细胞术检测MRD低于10-4为标准分免疫学缓解（ICR）组和非免疫学缓解（NICR）组，ICR组17例，NICR组12例，免疫学缓解率58.6%。ICR组抗原平均表达率0.009%，NICR组抗原平均表达率0.415%。

2.4 缓解组、未缓解组与对照组比较

研究发现：（1）缓解组与对照组比较，P＜0.05，有统计学意义，缓解组MRD阳性；（2）未缓解组与对照组比较，P＜0.05，有统计学意义，未缓解组MRD阳性；（3）缓解组与未缓解组比较，P＜0.05，有统计学意义，未缓解组MRD水平高于缓解组（请见表1）。

2.5 持续缓解组、复发难治组与对照组比较

研究发现：（1）持续缓解组与对照组比较，P＜0.05，有统计学意义，持续缓解组MRD阳性；（2）复发难治组与对照组比较，P＜0.05，有统计学意义，复发难治组MRD阳性；（3）持续缓解组与复发难治组比较，P＜0.05，有统计学意义，复发难治组MRD水平高于持续缓解组（请见表1）。

2.6 免疫学缓解组、非免疫学缓解组与对照组比较

研究发现：（1）免疫学缓解组与对照组比较，P＞0.05，无统计学意义，免疫学缓解组MRD阴性；（2）非免疫学缓解组与对照组比较，P＜0.05，有统计学意义，非免疫学缓解组MRD阳性；（3）免疫学缓解组与非免疫学缓解组比较，P＜0.05，有统计学意义，非免疫学缓解组MRD水平高于免疫学缓解组（请见表1）。

表1 各组抗原平均表达率比较（n, %）

3 讨论

AML是一组起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病，各亚型有不同的形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学特征。AML免疫表型所表达的抗原具有很大的异质性，这种异常表达的抗原不仅在初诊时AML中检测到，在形态学完全缓解后的骨髓和外周血中也可以检测，甚至在复发时仍可以检测到。临床MRD的检测一般都是利用白血病细胞的这种克隆性增生的特征为依据。近十年来国内外对急性白血病MRD的检测有很多的研究，目前急性淋巴细胞白血病MRD的检测已经比较规范，但是急性髓系白血病MRD的检测还不够规范，原因在于AML亚型多，免疫表型复杂，找到有效检测白血病相关免疫表型（Leukemia Associated Immunophenotypes, LAIPs）特异性CD抗原组合比较困难。Elaine CS等[12]应用22个CD标记物研究AML微小残留病。本研究选用急性髓系白血病各亚型白血病相关免疫表型中平均表达率较高的12个CD抗原构成一个特异性组合，即CD7、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD56、CD64、CD117、MPO和HLA-DR，利用它们相应的单克隆抗体，应用流式细胞术对AML各亚型的MRD进行动态检测。我们发现通过这种组合检测53例AML患者免疫表型初诊时抗原平均表达率23.97%，诱导缓解化疗结束时缓解组12.84%、未缓解组20.71%；继续巩固化疗第6月时持续缓解组4.427%、复发难治组16.32%，化疗第12月时免疫学缓解组0.009%、非免疫学缓解组0.415%。可见随着化疗的持续进行AML抗原平均表达率有逐渐降低的趋势，这种趋势通过流式细胞术散点图分析可以很好的描述。我们经过统计分析发现：（1）继续巩固化疗第6月时持续缓解组抗原平均表达率（4.427%）与对照组比较有显著性差异（P＜0.05），说明巩固化疗后处于细胞形态学持续缓解状态的AML中仍能检测出较高水平的MRD，该组患者尚未达到免疫学水平的缓解。（2）继续化疗第12月时免疫学缓解组抗原平均表达率（0.009%）与对照组比较无显著性差异（P＞0.05），说明这组患者中未能检测出MRD，可以说该组患者达到比形态学更深层次的缓解，即免疫学水平的缓解。

目前研究认为AML巩固化疗后MRD水平＞10-2，为高危组，复发率80%以上；MRD水平在10-3～10-2，为中危组，复发率40%以上；MRD水平在10-4～10-3，为低危组，复发率10%以上；MRD水平＜10-4，为极低危组，复发率5%以下。在我们研究中发现化疗第6月时持续缓解组抗原平均表达率8.625%，即8.625×10-2，按上述分级属高危组。化疗第12月时免疫学缓解组抗原平均表达率0.009%，即0.9×10-3，按上述分级属极低危组，说明该组患者预后特别好，可以进入维持化疗。

根据以上结论，本研究选用的一组特异性CD抗原可以对急性髓系白血病的MRD进行有效的监测，有助于提高检测MRD的可信度并减少检测成本，为临床治疗AML提供了可靠的参考。对本研究资料进行统计分析时我们还发现，第一次诱导缓解化疗后MRD水平比较低的患者后期复发的可能性比较少。这说明第一次缓解后检测MRD对预后有意义，但是MRD水平到底多少才会复发这个问题有待于进一步研究。多项研究提示巩固化疗后MRD水平小于10-4的患者复发可能性很小，可以进入维持化疗，但是对于维持化疗多长时间才能终止治疗这个问题也需要进一步研究。临床上应用流式细胞仪动态检测AML微小残留病有利于我们制定化疗方案，使我们能够避免MRD水平高的患者治疗强度不够，而MRD水平低的患者接受不必要的过度治疗，这将显著提高急性髓系白血病的治疗水平，为达到免疫学完全缓解提供可靠的依据。