2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定妇科洗剂抗菌效果的体外实验

庞芹，黄宇，吴敏，覃开羽

（1.广西中医药大学第三附属医院 妇科，广西 柳州；2.广西中医药大学第三附属医院 药学部，广西 柳州）

0 引言

阴道炎是妇科常见病，引起外阴瘙痒、灼痛、阴道分泌物增多，影响患者正常生活，既往报道证实致病菌是引起阴道炎的主要病因，致病菌种类繁多，阴道炎发病率逐年上升[1-3]。目前临床有关阴道炎的外用药物种类较多，疗效不一[4]。妇科洗属中药外用制剂，本研究所用妇科洗是本院协定处方，近年来妇科洗剂在院外患者使用逐渐增多[5]。有关妇科洗在阴道炎患者中的应用，临床尚未有统一标准[6]。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazole Chloride, TTC）被多次推荐为抗菌实验试剂[7]，为规范妇科洗用药，本研究采用TTC法探讨其抗菌效果。

1 资料与方法

1.1 实验试剂

TTC由上海亨代劳生物科技有限公司提供，实验菌株包括大肠杆菌（ATCC15597）、金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、表皮葡萄球菌（ATCC49134）粪肠球菌（ATCC51299）、奇异变形杆菌（ATCC12453）白色念珠菌（ATCC14053）、铜绿假单胞菌（ATCC9027）、肺炎克雷伯菌（ATCC13883）及阴沟肠杆菌（ATCC700323）。妇科洗由本院协定处方，煎药房煎制而成，规格300mL。新西兰兔（清洁级）由苏州湖桥生物科技有限公司提供。AMRESCO增菌液由上海抚生生物科技有限公司提供。

1.2 菌液备制

取冷冻保存的菌株斜面培养物，分别放入增菌液试管中，37 ℃下孵育24h，然后在培养基平板上将悬液进行分离，37 ℃下再次孵育24h。然后将菌落接种在营养琼脂斜面，用生理盐水冲洗除去斜面菌苔。将营养琼脂培养基融化，冷却后加入TTC和1.0 mg/mL琼脂液，稀释成1×107cfu/mL浓度，得到实验菌液后备用。

1.3 灭菌实验

取妇科洗5.0mL与0.5 mL菌液混匀，作用10 min，然后制成琼脂平板，37 ℃下孵育24h后，计算菌落数和杀菌率。菌落数和杀菌率计算方法均参照《中国药典》附录微生物限度检查法：取50 cfu/mL含菌液1 mL，加入灭菌平皿，培养72h后计数，记录菌落颜色变化，据此作为菌落计数，然后计算杀菌率。最低抑菌浓度计算：将妇科洗按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32比例进行稀释，再将稀释后的妇科洗溶液按每2 mL妇科洗+18 mL培养基混匀备用。取少量待测菌株研磨，配制0.5麦氏单位菌悬液，再以1:10比例稀释，滴种于各妇科洗培养基中，37 ℃孵育24h后，记录最低抑菌浓度，以无菌生长的最高稀释浓度作为最低抑菌浓度。最低记录致病菌开始被抑制和完全被抑制时TTC浓度。以相邻菌落团数量明显减少或试验菌颜色明显变化为致病菌开始被抑制时间，以菌落团被杀灭消失为完全被抑制。

1.4 毒性实验

取清洁级新西兰兔，用医用剪刀剪去兔脊柱两侧区域兔毛，每侧30 mm×30 mm，一侧用沾有妇科洗的纱条浸润贴敷，另一侧作为对照。

2 结果

2.1 妇科洗杀菌效果

妇科洗药液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、奇异变形杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌及肺炎克雷伯菌均具有较好的杀菌效果，随着时间延长，杀菌率有上升趋势，见表1。

表1 妇科洗杀菌效果（%）

2.2 各致病菌开始被抑制和完全被抑制时TTC浓度

在加入TTC的增菌液中，各致病菌开始被抑制和完全被抑制时TTC浓度，见表2。

表2 致病菌开始被抑制和完全被抑制时TTC浓度（mg/mL）

2.3 妇科洗最低抑菌浓度结果

妇科洗对阴道炎各菌种均具有一定程度的杀菌作用，其强度依次为大肠杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌及表皮葡萄球菌，见表3。

表3 妇科洗最低抑菌浓度结果（g/L）

2.4 毒性试验结果

毒性试验结果显示，未出现红肿、溃烂等毒副反应。

3 讨论

阴道炎是临床最常见感染性疾病。目前，随着医疗技术的进步，阴道炎疗效逐渐改善[8]。中医药引起毒副作用少的特点受到临床医师和患者青睐，在阴道炎治疗尤其是院外患者自行治疗方面占据重要地位[9]。外用洗剂可直接作用于病变部位，发挥清洗、抗菌作用。妇科洗属于中药外用成剂，包含黄柏、蛇床子、地肤子、松岗油等成分，黄柏性寒，具有清热燥湿作用[10]，药理学研究证实其有效提取物川黄柏生物碱具有良好的抗炎杀菌作用[11]。解光艳等[12]则认为蛇床子素可通过破坏外阴念珠菌病混合菌的生物膜，进而达到灭菌效果。而地肤子对大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌及白色念珠菌均具有抑菌作用[13]。近年来有关妇科洗在临床应用已有报道[14]，但用药方案不一。

本研究通过体外实验检测妇科洗对阴道炎常见致病菌种的抑制作用，并计算最低抑菌浓度，为临床合理用药提供参考。TTC即C19H15CIN4，属无色氧化剂，分解性强，还原形成三苯甲臜，能清晰显示菌落分布，TTC被作为指示剂广泛用于临床[15]。另外，本研究琼脂浓度为1.0 mg/mL，Shinu P等[16]发现以此浓度可使菌落呈短线或圆球状，并使菌液显色，减少漏检，这对于提高检测计算的准确性具有重要意义。另外，也有学者认为样品试剂中可能因含有其他菌种而影响菌落计数，造成结果不准确。TTC不仅具有显色效果，且具有一定的抑菌作用，这也可能影响对妇科洗灭菌效果的检测结果。其干扰作用可能随TTC浓度增加而增大，理论上既能显示相同杀菌抑菌效果、干扰作用又小的浓度为最佳TTC浓度，本研究设计使用了不同梯度浓度的TTC目的也在于此。此外，本研究显示TTC对不同菌株开始被抑制和完全被抑制时间有所不同，这可能与其敏感度有关，而对于不同来源的同一菌株在TTC中是否具有敏感性差异也有待今后进一步研究。

综上，TTC用于妇科洗的体外灭菌实验，有助于提高菌落显色效果，减少漏检，但有关其与不同致病菌敏感性关系有待深入研究。