不同施肥处理对何首乌单株鲜质量和成分积累的影响△

李娇，孟磊，张晶，魏胜利，2*，兰才武

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 102488；3.昌昊金煌(贵州)中药有限公司，贵州 贵阳 557500

何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根[1]，具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养身安神等作用，主治血虚身痛、心烦失眠、劳伤多汗等[2-3]。何首乌应用范围广泛[4]，随着人们对何首乌需求量的增加，其种植面积不断扩大。但是，关于何首乌施肥的研究大部分集中于田间管理[5-6]及施肥对何首乌农艺性状[7-8]、光合特性[9]、可溶性多糖含量和蛋白质含量[10]的影响，而施肥对于何首乌单株鲜质量和其他有效成分的影响却鲜有报道。近年来研究表明，二苯乙烯苷类、游离蒽醌类和结合蒽醌类成分是何首乌的主要有效成分，也是何首乌质量控制的指标成分[11-12]。因此，本研究采用“3414”的施肥方法，在贵州实验基地对移栽的何首乌进行施肥试验，采用一测多评法测定何首乌有效成分的含量，运用极差分析和主成分分析法研究施肥量对何首乌有效成分的影响，以期在提高单株鲜质量的基础上，尽可能提高何首乌的品质。

1 材料

1.1 样品

本试验于2017年4月开展，选择1年生何首乌基地进行施肥实验，10月底采收2年生何首乌，经北京中医药大学魏胜利教授鉴定为蓼科何首乌属何首乌PolygonummultiflorumThunb.。

1.2 试药

对照品2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(反式-二苯乙烯苷，批号：110844-20512，纯度：91.0%)、大黄素(批号：110750-200110，纯度：98%)、大黄素甲醚(批号：110758-201415，纯度：98%)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(批号：110758-21415，纯度：98%)均购于中国食品药品检定研究院；大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(批号：Z25F8B30059，纯度：98%，上海源叶生物科技有限公司)。顺式-二苯乙烯苷按参考文献[13]方法，通过反式-二苯乙烯苷在365 nm下转化而得。甲醇(分析纯，北京化工厂)；甲醇、乙腈(色谱纯)均购于Fisher公司；水为屈臣氏蒸馏水。

1.3 仪器

1260型高效液相色谱仪(包括G1314F 1260 VWD型检测器，美国Agilent公司)；KQ5200D型超声清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；ME104型万分之一电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BT 25S型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法

2.1 施肥方法

采用原中华人民共和国农业部2011年下发的“3414”试验方案，施肥试验共设氮、磷、钾3个因素，4个水平，14个处理。0水平指不施肥，2水平是指当地推荐的施肥量，1水平=2水平×0.5倍(此水平为减量下的施肥量)，3水平=2水平×1.5倍(此水平为增量下的施肥量)。氮的4个水平分别为N0、N1、N2、N3(0、6.9、13.8、27.6 g·m-2)。磷的4个水平分别为P0、P1、P2、P3(0、3.2、6.3、9.6 g·m-2)。钾的4个水平分别为K0、K1、K2、K3(0、6.7、13.5、20.2 g·m-2)。氮肥为尿素，其含氮量为46.4%；磷肥为过磷酸钙，其五氧化二磷质量分数为12%；钾肥为硫酸钾，其氧化钾质量分数为50%，具体施肥量见表1。实验地土壤全氮质量分数202.81 mg·kg-1、速效磷30.81 mg·kg-1、速效钾153.78 mg·kg-1。14个处理有42个小区，小区长10 m、宽3 m，排列方式采用随机区组，重复3次。实验地的四周设置保护行，行距30 cm，株距30 cm。

表1 何首乌“3414”追肥试验不同处理的施肥量 g·m-2

2.2 单株鲜质量测定

2017年10月于各小区取样，每个小区随机取样30株，测定单株鲜质量。

2.3 含量测定

2.4 统计分析

运用SPSS 22.0、Origin 8.0软件对何首乌单株鲜质量、二苯乙烯苷类、游离蒽醌类、结合蒽醌类成分含量进行数据处理及统计分析。

3 结果

3.1 不同施肥处理对何首乌单株鲜质量的影响

运用Duncan′s多重比较发现，不同施肥处理的何首乌单株鲜质量间差异均有统计学意义(P<0.01)，说明氮、磷、钾肥的使用可显著影响何首乌的单株鲜质量。对不同施肥水平的何首乌单株鲜质量做极差分析，其中，氮因子的极差为29.18、磷因子的极差为31.90、钾因子的极差为34.11，说明何首乌单株鲜质量受钾因子的影响最大。如图1所示，14个处理组中何首乌单株鲜质量排在第一位的是T8，而当氮肥和磷肥均处于第二水平时，何首乌单株鲜质量的高低顺序为T8>T10>T6>T9。因此，推测仅使用氮肥和磷肥对单株鲜质量的影响较为显著。当磷肥和钾肥均处于第二水平下，何首乌单株鲜质量的高低顺序为T6>T3>T2>T11，即在氮肥第二水平下，何首乌单株鲜质量可以达到最大值，而在氮肥第3水平时，何首乌单株鲜质量反而下降，表明合理的氮肥施用量可促进何首乌的单株鲜质量增加，高氮肥施用量反而可降低何首乌的单株鲜质量。当氮肥和钾肥均处于第二水平时，何首乌单株鲜质量的高低排序为T6>T4>T5>T7，说明了高磷水平不能够促进何首乌单株鲜质量的增加，低磷水平才能够促进何首乌单株鲜质量的增长，进而使其单株鲜质量增加。因此，若想获得单株鲜质量较高的何首乌，可采取T8的方式进行施肥处理。

图1 施肥处理对2年生何首乌单株鲜质量的影响

3.2 不同施肥处理对何首乌中成分的影响

通过Duncan′s多重比较发现，不同施肥处理间各有效成分及各类含量之和差异均有统计学意义(P<0.01)。同时，对不同水平氮、磷、钾肥处理下的二苯乙烯苷类成分含量做极差分析。其中，氮因子的极差为0.45、磷因子的极差为0.42、钾因子的极差为0.43，这充分说明了，氮、磷、钾肥料对何首乌二苯乙烯苷类成分含量也有一定的影响，并且其二苯乙烯苷类含量受氮因子的影响最大。如图2所示，氮肥和钾肥均处于第二水平时，二苯乙烯苷含量的高低顺序为T5>T7>T6>T4，使用磷肥对其影响较大，但在低磷水平下，二苯乙烯苷含量明显高于其他水平。磷、钾水平相同时，何首乌二苯乙烯苷类成分含量随肥料中氮含量增加而升高，顺序为T11>T6>T3>T2。因此，采取T1或T5处理均可提高二苯乙烯苷含量。

图2 施肥处理对2种二苯乙烯苷类成分总量的影响

对不同水平氮、磷、钾肥处理下结合蒽醌类成分含量做极差分析。其中，氮因子的极差为0.09、磷因子的极差为0.09、钾因子的极差为0.12，说明氮、磷、钾肥料对何首乌结合蒽醌类成分也有一定的影响，其结合蒽醌类成分含量受钾因子的影响最大。如图3所示，当氮、磷水平一致时，结合蒽醌类成分总量为T6>T10>T9>T8，说明了钾肥对于结合蒽醌类成分的累积有促进作用，不使用钾肥的含量明显低于使用钾肥的含量。当磷、钾水平一致时，结合蒽醌类成分总量为T6>T11>T2>T3，但是，当氮、磷、钾水平为0时，2种结合蒽醌类成分总量达到最大值，说明T1或T6均可提高结合蒽醌类成分含量。

图3 施肥处理对2种结合蒽醌类成分总量的影响

对不同水平氮、磷、钾肥处理下的游离蒽醌类含量做极差分析。其中，氮因子的极差为0.02、磷因子的极差为0.13、钾因子的极差为0.21，这充分说明了，氮、磷、钾肥料对何首乌游离蒽醌类成分也有一定的影响，并且其游离蒽醌类成分含量受钾因子的影响最大，其次为磷因子和氮因子。如图4所示，当磷、钾水平一致时，很明显不使用氮肥，游离蒽醌类成分含量反而最高，当氮、钾水平一致时，不使用磷肥，游离蒽醌类成分含量反而最高，当氮、磷水平一致时，钾肥越多，含量越高。故可采取T2处理提高游离蒽醌类成分含量。

图4 施肥处理对2种游离蒽醌类成分总量的影响

综上所述，二苯乙烯苷类含量排在前三的处理组分别是T1、T5、T7；结合蒽醌含量排在前三的处理组分别是T1、T6、T12；游离蒽醌含量排在前三的处理组分别是T2、T4、T7。可见当不使用肥料时，二苯乙烯苷类以及结合蒽醌类含量相对较高，不含氮肥或者磷肥处理时，游离蒽醌类含量较高。

3.3 最佳施肥方案的筛选

运用主成分分析法，参照单株鲜质量及二苯乙烯苷类、结合蒽醌类、游离蒽醌类的各项含量为指标性成分，进行主成分分析。由降维结果可得2个主成分，PC1和PC2，累积方差贡献率84.35%，具有代表性，可以用来评价何首乌质量，得到各施肥处理组的综合得分。由表2可知，得分前三的处理为T1、T6、T11，主成分得分分别为2.21，1.25、0.20。这3种处理均可得到综合品质较好的何首乌，但由于在实际生产中更重视何首乌的单株鲜质量，故综合分析认为，施肥方案应选择T6处理，即氮肥13.8 g·m-2、磷肥 6.3 g·m-2、钾肥13.5 g·m-2。

表2 各施肥处理组的综合得分

4 讨论

何首乌作为大宗药材，受到古今医家、饮食家所推崇，是滋补肝肾、延年益寿的佳品。野生何首乌更是受到广泛关注，由于近年来野生何首乌资源严重匮乏，现今市场上流通的大多为何首乌栽培品，因此把控与何首乌质量密切相关的种植环节显得尤为重要。目前，对何首乌栽培技术的研究大多集中在田间管理，但相关研究表明，施肥对何首乌的影响也较大，因此，合理施肥是提高何首乌单株鲜质量和有效成分含量的重要保证。如张宝生[15]开展了何首乌磷钾肥施肥量和种植密度试验，发现施肥和种植密度对何首乌产量有一定影响，但其忽略了对何首乌有效成分的影响。王华磊等[16]在对何首乌栽培密度的研究中，发现不同密度对何首乌块根的生长、产量和品质的影响均有统计学意义，适宜的种植密度不仅可以保证产量的积累，亦可提高何首乌中二苯乙烯苷和结合蒽醌含量，但仍存在产量和含量指标的不完善性。

大多数研究认为，氮肥是影响药材产量及鲜质量的首要因素，而磷肥和钾肥是改善药材品质的关键因素。李询等[17]通过“3414”施肥试验，测定怀牛膝秋子的产量，折干率，β-蜕皮甾酮、齐墩果酸、浸出物和多糖含量，认为氮肥和磷肥对其产量的影响较大，钾肥对其产量影响最小，磷的施用量显著影响多糖的含量，钾元素对浸出物含量影响较大，这与左晓燕[18]的结果一致。陈暄等[19]通过正交法研究芍药生长过程中氮磷钾肥对芍药根鲜质量、芽头数、分根数的影响，发现氮肥是影响其鲜质量的重要因素。在本研究中，发现对于何首乌而言，钾肥反而是促进其单株鲜质量的第一影响要素，除此之外，磷肥也对何首乌单株鲜质量有显著的影响。本研究结果表明，施肥对单株鲜质量的影响较大，且氮磷钾肥配比对单株鲜质量和有效成分积累具有一定影响，其中单株鲜质量和蒽醌类主要受到钾肥的影响，二苯乙烯苷类主要受到氮肥的影响。由本研究可知，对何首乌使用氮肥13.8 g·m-2、磷肥 6.3 g·m-2、钾肥 13.5 g·m-2时，既可以避免过度施肥对环境的影响，又可以减少成本、提高效益。