黄芪活性成分抗衰老作用机制的网络药理学研究△

张婷，王宏雅，魏桂杰，赵雯雯，孙秀蕊，张哲，马鹏凯，张玉杰

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge或蒙古黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根[1]，是重要的补气药之一，在抗衰老方面具有重要作用[2-4]。吴爽等[5]研究结果表明，发酵黄芪可提高自然衰老大鼠血清及脑组织抗氧化应激指标水平。耿广琴等[6]研究结果表明，黄芪提取物能显著提高衰老模型小鼠脑组织总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，显著降低丙二醛(MDA)水平，明显减轻海马神经元形态结构衰老。闫晋晋等[7]研究结果表明，黄芪总提取物可以明显提高D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠的机体抗氧化及抗衰老能力。廖勇梅等[8]研究结果表明，穴位注射黄芪对D-半乳糖引起的皮肤衰老具有一定的预防与延缓作用。有关黄芪抗衰老作用机制的研究一直备受重视。文献研究表明，黄芪及其活性成分对衰老基因的调控、细胞的凋亡有一定的积极作用[9]，但其抗衰老成分及机制尚待明确。

衰老是指生物个体随年龄的增长，其细胞、组织、器官发生系统性病变，从而导致衰老相关疾病的发生，严重损害其健康[10]。已有研究表明，衰老与细胞应激反应、能量代谢、干细胞衰竭等有关[11]，但是衰老及衰老相关疾病发生机制有待深入研究。

中药具有多成分、多靶点的特点，且不同成分之间还具有一定的协同作用[12]。网络药理学基于系统生物学、组学和计算生物学，从整体角度阐释药物与疾病的关联性，适用于中药药效机制研究[13-14]。因此，本研究采用网络药理学方法，研究黄芪多成分、多靶点、多通路的作用特点，探讨黄芪抗衰老的药效物质基础和作用机制。

1 材料与方法

1.1 黄芪活性成分的收集与筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，hettp：//lsp.nuw.edu.cn/tcmsp.php)输入关键词“huangqi”进行检索，得到其化学成分，设置口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18筛选活性化合物，同时纳入文献报道的具有明显药理活性的成分[15]。

1.2 黄芪候选成分潜在靶点预测

利用PharmMapper数据库(http：//59.78.98.102/pharmmapper/index.php)[16]筛选得到黄芪候选活性成分的mol2格式文件，获取靶点蛋白编号(PDB ID)、名称和得分(fit score)。Fit score体现了分子与靶点之间的匹配程度，其值大小与匹配程度呈正相关。在UniProt数据库中输入筛选获得的fit score>3的蛋白编号，作为黄芪主要活性成分的潜在作用靶点。

1.3 衰老靶点筛选

在OMIM数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和GeneCards数据库(https：//www.genecards. org)中输入关键词“aging”，搜索与衰老相关的疾病靶点。运用Venny平台(http：//bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/)将黄芪药效成分靶点与衰老相关靶点取交集，得到黄芪治疗衰老的交集靶点。使用Omicshare平台(http：//www.omicshare.com)绘制黄芪治疗衰老靶点韦恩图。

1.4 黄芪-成分-靶点-疾病网络构建

将上述黄芪候选化合物、衰老、衰老与活性成分的交集靶点作为节点，通过Cytoscape 3.2.1软件构建黄芪-成分-靶点-衰老网络[17]。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及核心靶点筛选

在STRING 数据库(https：//string-db.org/)中输入黄芪治疗衰老的潜在作用靶点，设置条件“minimum required interaction score=0.9”和“hide disconnected nodes in the network”，获取蛋白相互作用信息，并利用Cytoscape 3.2.1软件绘制PPI网络图。根据节点度值大小筛选出核心靶点。

1.6 分子对接验证

以黄芪关键活性成分为配体，通过PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)查找蛋白相互作用网络中度值靠前的靶蛋白3D结构作为受体，利用CB-Dock网站(http：//cao.labshare.cn/cb-dock/)进行分子对接。

1.7 基因本体(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

为探究靶标蛋白信号转导途径与功能，将交集靶点导入DAVID数据库，设定P≤0.05、Q≤0.05，对相互作用的靶点进行GO生物学过程和KEGG信号通路富集分析。

2 结果

2.1 黄芪活性化合物及靶点筛选

通过TCMSP查找黄芪活性成分，设置OB≥30%、DL≥0.18，筛选得到活性化合物20个，纳入文献报道的活性成分后共得到24个化合物[18]。另外，黄芪皂苷Ⅰ～Ⅳ的OB和DL值虽较低，但研究显示这些成分为黄芪的关键活性成分，且药理作用明显，因此将这4个成分也纳入后续黄芪抗衰老作用的机制研究中。按照1.2项下方法共筛选得到黄芪活性成分靶点385个。

2.2 衰老及相关疾病靶点

在OMIM数据库、GeneCards数据库中以“aging”作为关键字进行搜索，发现23 997个潜在作用靶点。将黄芪有效成分的靶点与衰老的靶点取交集，得到与黄芪抗衰老作用相关的靶点377个，结果见图1。

图1 黄芪抗衰老靶点韦恩图

2.3 黄芪-成分-靶点-疾病网络构建

通过Cytoscape 3.2.1软件构建黄芪-成分-靶点-衰老网络(图2)。由图2可知，活性成分和多数靶点具有较多的交互作用，充分说明黄芪是通过多成分、多靶点、多通路协同作用的方式起到抗衰老的作用，其中活性成分黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ、芒柄花素、异鼠李素、山柰酚和槲皮素均能与10个以上的靶点相连接，推测这些成分是黄芪抗衰老的主要活性成分。

注：红色表示疾病；绿色表示药物；黄色表示黄芪活性成分；橘色表示预测靶点。图2 黄芪化合物-靶点-衰老作用网络

2.4 交集靶点PPI网络构建及核心靶点筛选

将得到的377个交集靶点导入STRING数据库，获取PPI关系，结果见图3。根据度值大小筛选出排名前10的关键靶蛋白，结果见表1。

图3 黄芪抗衰老交集靶点相互作用网络

表1 黄芪抗衰老PPI网络关键靶点

2.5 分子对接

通过PDB数据库查找黄芪活性成分黄芪皂苷Ⅰ(MOL000401)、黄芪皂苷Ⅳ(MOL000407)、槲皮素(MOL000098)、山柰酚(MOL000422)与靶点Akt1、MAPK1相互作用的三维结构，下载化合物MOL结构式，分别导入CB-Dock网站进行分子对接，结果见表2。结合能<0说明受体与配体间可以自发结合，黄芪4种关键活性成分与靶蛋白的结合均较稳定，结果见图4。

表2 黄芪抗衰老主要活性成分与靶蛋白Akt1和MAPK1的对接结果

注：A.黄芪皂苷Ⅰ与Akt1；B.黄芪皂苷Ⅳ与Akt1；C.槲皮素与Akt1；D.山柰酚与Akt1；E.黄芪皂苷Ⅰ与MAPK1；F.黄芪皂苷Ⅳ与MAPK1；G.槲皮素与MAPK1；H.山柰酚与MAPK1。图4 黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅳ、槲皮素、山柰酚与靶蛋白Akt1和MAPK1的对接分析

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析

在DAVID数据库中输入衰老和黄芪活性成分的交集靶点，分别进行GO富集分析和KEGG通路注释富集分析。GO分析由生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)3部分组成。根据P值大小，分别列举排名前20的GO条目(图5)。由图5可以看出，作用靶点主要富集在对金属离子的响应、对活性氧的反应、氧化应激反应、对脂多糖的反应、活性氧代谢等生物过程；涉及核受体活动、转录因子活性、类固醇激素受体活性、抗氧化活性、有机酸结合等分子功能；发生在膜筏、囊腔、突触前膜、突触后膜等细胞组分。根据P≤0.05和Q≤0.05，KEGG富集得到信号通路161条，选取前20条KEGG信号通路，通路详细信息见表3。分析显示，靶点显著富集于晚期糖基化终末产物(AGE)-糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、白细胞介素-17(IL-17)信号通路、人类巨细胞病毒感染、流体剪切应力和动脉粥样硬化及与癌症相关的多个信号通路。

注：A.BP；B.MF；C.CC。图5 黄芪抗衰老作用靶点的GO富集分析

表3 黄芪抗衰老作用靶点KEGG通路信息

3 讨论

本研究借助网络药理学的方法，探讨黄芪抗衰老的物质基础及其分子机制。由图2可知，黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ、芒柄花素、异鼠李素、山柰酚和槲皮素等化合物为网络中的重要节点，推测这些化合物可能是黄芪抗衰老的物质基础。朱嘉欢等[19]研究结果表明，芒柄花素可显著促进衰老造血干细胞增殖和降低细胞衰老率。顾艺婧等[20]通过体内外实验探究槲皮素对骨相关细胞衰老的影响，证实槲皮素可通过抑制细胞衰老缓解由雌激素缺乏导致的骨丢失。章诗迪[21]研究结果表明，环黄芪醇提取物具有一定的端粒酶激活作用，继而提示其具有抗衰老作用。这些实验成果进一步验证了本研究预测结果的可靠性。

黄芪化合物-靶点-衰老网络和PPI网络显示，Akt1、MAPK1、Jun、IL-6和MAPK8与多个化合物具有交互作用且度值较高，在网络图中发挥关键作用，提示其可能是黄芪抗衰老的潜在靶点。Akt可通过抑制叉头转录因子(FOXO)介导的基因转录，从而破坏sestrin 3等蛋白对活性氧(ROS)的清除过程，而ROS的累积被证明可以调节细胞生存周期和衰老过程[22]。MAPK信号通路是控制细胞增殖、氧化应激、存活和凋亡等多种基本细胞进程的重要通路[23]。c-Jun癌蛋白与其他Jun/Fos成员通过异二聚作用形成激活子蛋白-1(AP-1)，而AP-1通过控制基因表达调节一些重要的细胞功能，如细胞周期、迁移、增殖和凋亡[24]。研究表明，旁分泌的IL-6可以诱导初始细胞增殖，自分泌的IL-6可导致细胞衰老，限制细胞恶性转化和侵袭性增长，在垂体腺瘤发生与发展中起至关重要的作用[25]。

分子对接结果表明，黄酮和皂苷类化合物与靶蛋白Akt1和MAPK1结合性较好，为网络药理学预测靶点的可靠性提供有力依据。GO功能显著富集在氧化应激反应、活性氧代谢等生物过程。KEGG通路富集分析结果显示，黄芪可通过AGE-RAGE信号通路、人类巨细胞病毒(HCMV)感染及与癌症相关的多个信号通路起到抗衰老作用。研究表明，AGEs通过与RAGE结合促使细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶激活，导致多种细胞因子与生长因子的合成与释放，诱发细胞内ROS生成增多[26]。HCMV作为常见的病原体，在老年人群中的感染率很高，和多种慢性疾病共同作用于机体，影响机体免疫功能[27]。癌症相关通路表明，衰老与肿瘤密切相关。已有研究表明，衰老和肿瘤互相影响、互相促成，衰老是肿瘤发生的一个重要风险因素，肿瘤发生一定程度上是衰老的自然结果[28]。

本研究在网络药理学的基础上，对黄芪的活性成分和其抗衰老过程中的多靶点、多途径特性进行了探讨，初步解释了黄芪抗衰老的作用机制，为黄芪抗衰老活性进一步的体内外实验验证及抗衰老药物的筛选和评价提供参考。