代谢性疾病中巨噬细胞功能及靶向递送治疗研究进展*

李鹤，谭晓川，姜栋，张宇佳，郑稳生

(北京协和医学院&中国医学科学院药物研究所药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室，北京 100050)

巨噬细胞是先天免疫的组成部分，它可以吞噬病原体或细胞碎片，并分泌营养因子、免疫递质和效应子等发挥作用[1-2]。正常情况下，机体巨噬细胞表现为静息状态，宿主微环境改变产生不同的炎性因子来影响巨噬细胞极化，使其参与宿主免疫反应。根据表型和功能可以将其分为经典活化M1型巨噬细胞(classically activated macrophages)和替换活化的M2型巨噬细胞(alternately activated M2 macrophages)[3-4]。M1型巨噬细胞可以被γ干扰素(interferon gamma，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导[5]，而M2型巨噬细胞可以被白细胞介素4(interleukin 4，IL-4)或IL-13诱导[6]。极化巨噬细胞会分泌多种细胞因子，M1型巨噬细胞可以分泌TNF-α、IL-6、IL-12、IL-23、一氧化氮、活性氧等因子介导促炎过程，防止异物入侵，具有强大的杀灭微生物和抗肿瘤活性[7-8]；M2型巨噬细胞释放Ym1(chitinsea 3-like 3)、精氨酸酶1、IL-10和多胺等，具有抗炎活性，并参与细胞增殖和组织修复、免疫耐受和肿瘤的生长和转移[9-10]。巨噬细胞的M1/M2极化不是一个固定概念，而是一个动态过程，可以在生理和病理条件下逆转[11-12]。因此M1和M2巨噬细胞分别是炎症相关疾病和癌症有希望的治疗靶点之一。

巨噬细胞也可以根据所处位置进行分类。与来自骨髓并在血液中循环的单核细胞不同，分化的组织驻留巨噬细胞，包括肝脏库弗细胞(Kupffer cells，KCs)、脂肪中的组织巨噬细胞(adipose tissue macrophages，ATMs)、肺中的肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages)、脾中的红髓和边缘区巨噬细胞(red pulp and marginal zone macrophages)、脑中的小胶质细胞(microglia)等分布在体内各组织。其中，KCs和ATMs是两种主要代谢组织相关的巨噬细胞[13-14]。

1 巨噬细胞在代谢性疾病中的作用

巨噬细胞在代谢性疾病中起着非常重要的作用，是治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)等疾病的理想靶点。

1.1AS AS是含高胆固醇和载脂蛋白B的脂蛋白在壁内滞留引发的动脉壁慢性炎症疾病[15]。巨噬细胞在AS性心血管疾病的发展中起核心作用[16]。目前研究认为，低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)是AS病变中脂质蓄积的主要来源，这些促炎性颗粒触发了内皮激活，将单核细胞募集到内皮下并分化为M1型巨噬细胞，随后巨噬细胞吞噬未修饰和修饰的脂蛋白，转化为富含胆固醇的泡沫细胞，泡沫细胞的积累有助于脂质储存和AS斑块生长[17]。巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子、趋化因子和活性氧维持局部炎症反应，即将死亡的巨噬细胞形成斑块中的坏死核心，极易导致血管破裂，提高随后的心肌梗死以及卒中的风险[18]。与对照动物相比，在AS动物模型，如Apoe-/-小鼠中，循环促炎性单核细胞数量显著增加[19]，并且在AS病变区域发现促炎性M1型巨噬细胞标志物TNF-α[20]。尽管许多细胞类型都有助于形成AS斑块，包括内皮细胞、单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和平滑肌细胞等，但巨噬细胞在AS病理生理中的作用不可替代[21]，因此巨噬细胞是AS治疗的关键靶标之一。

1.2NASH 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)及其炎症亚型NASH是引发全球范围内肝脏相关疾病发病率与死亡率的主要原因[22]。TILG等[23]研究表明，KCs活化和促炎细胞因子释放在NASH炎症和肝损伤级联中起着核心作用。M1型巨噬细胞产生的促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α等，可以直接作用于肝细胞并促进脂肪变性、炎症和肝细胞损伤[24]。实验模型证明，KCs激活代表着肝损伤开始，耗竭KCs可以显著降低肝脏炎症和脂肪变性，并减轻肝脏损伤[25]。巨噬细胞定向疗法治疗NAFLD和NASH已经成为了目前研究较多的一种干预策略，主要包括抑制KCs激活，抑制单核细胞向肝脏的募集，以及促进巨噬细胞向抑炎的M2表型极化等方法[26]。

1.3T2D 我国是全球成年糖尿病患者最多的国家，其中T2D患者占糖尿病患者总数的90%。胰岛素抵抗是T2D的核心特征[27-28]。巨噬细胞在慢性炎症和胰岛素抵抗中起着重要作用[29-30]。在个体处于较瘦状态时，ATMs多为M2极化状态[31]，M2型巨噬细胞可分泌IL-10、IL-1和儿茶酚胺等因子来调节脂质代谢并参与阻断炎症反应[32-33]，参与维持胰岛素敏感性和葡萄糖稳态[34]。而在肥胖状态下，在脂肪组织、肝脏和肌肉等胰岛素靶器官中观察到巨噬细胞浸润，M1型巨噬细胞分泌大量炎症细胞因子，对胰岛素信号传递产生抑制作用，并促进了慢性炎症和胰岛素抵抗的发生[35-37]。白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)是肥胖状态下产生慢性炎症的主要部位，ATMs的积累是调节炎症的关键因素[38-39]。在正常个体，巨噬细胞约占WAT的10%，而在肥胖者和小鼠中，巨噬细胞可以增加到近40%[40-41]。脂肪组织中的M1型巨噬细胞主要包围在坏死的脂肪细胞周围形成冠状结构(crown-like structures，CLSs)，在吞噬脂肪细胞时持续释放促炎性细胞因子[42]。因此在T2D中，可以通过耗竭ATMs和KCs，以及下调M1型巨噬细胞比例、上调M2型巨噬细胞比例来增加胰岛素敏感性[43]。

2 巨噬细胞靶向释药载体

纳米粒的设计和递送是巨噬细胞靶向的常用策略。根据定义，纳米粒是直径1～1000 nm范围的粒子。它们的表面连接物决定了它们是针对特定的细胞类型(由于受体介导的特异性)还是针对整个组织[44]。连接特定配体后纳米粒具有了一定的特异性，可以减小脱靶效应和载体的毒性[44]。常用的载体材料有壳聚糖(chitosan，CS) 、聚丙交酯-共-乙交酯[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]、聚乳酸(polylactic acid，PLA)和葡聚糖(dextran，DEX)等[44]。4～30 nm纳米粒可以很容易被巨噬细胞吸收[45]。在瘦小鼠中腹膜注射后，纳米粒优先在肝脏积累；而在肥胖小鼠中，纳米颗粒优先在脂肪中积累。纳米载体可以将地塞米松特异性地递送至与肥胖相关的炎性巨噬细胞中。KUNJACHAN等[46]开发了包裹多柔比星的壳聚糖纳米粒，发现巨噬细胞对壳聚糖微粒显示了有效的内吞摄取。

脂质体特定理化性质有利于单核细胞和巨噬细胞的摄取，也是靶向巨噬细胞简单有效的手段之一。EPSTEIN-BARASH、TAKANO等[47-48]比较了直径50～800 nm的，由中性、正电荷或负电荷脂质组成的多种脂质体被巨噬细胞摄取的效率，发现由二棕榈酰卵磷脂(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol，DSPG)和胆固醇以3：1：2摩尔比组成的、直径较小(85 nm)带负电荷的脂质体是被巨噬细胞内在化的最佳选择，并且直径较大且带正电荷的脂质体可以诱导细胞因子的活化和细胞毒性。尽管已有文献报道巨噬细胞对小脂质体(直径<100 nm)的摄取更多[49]，但其他研究表明，随着尺寸增加，巨噬细胞对脂质体的吸收也会改善[50]。因此，脂质体最佳直径可能取决于多种因素，包括靶细胞和脂质体制剂的特性，例如受体介导的或非受体介导的摄取[47]。阳离子脂质体可以实现药物的高效细胞递送，常用于体外基因递送[51]。带正电荷的脂质体与带负电荷的细胞膜和细胞表面蛋白聚糖之间的静电相互作用可以促进细胞摄取，但阳离子脂质体会引起细胞毒性，从而限制了其在临床上的安全性[52]。而带有负电荷的脂质，例如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)可以被巨噬细胞优先识别[49]，FIDLER等[53]发现中性磷脂酰胆碱(phosphatidyl cholines，PC)和PS组成的阴性脂质体被巨噬细胞摄取更多。CHONO等[54]发现使用由蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和过氧化二异丙苯(dicumyl peroxide，DCP)以摩尔比7：2：1比例组成的，直径分别为70，200和500 nm的阴离子脂质体可以用于向巨噬细胞输送药物，从而治疗AS。巨噬细胞和泡沫细胞的体外吸收随着粒径的增加而得到改善，但是在体内，使用直径200 nm脂质体可在AS小鼠中实现最佳主动脉递送[55]。

此外，还有其他载体可以用于巨噬细胞靶向。碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)具有较大的表面积和较高的长径比，已经成为递送各种生物活性物质的新型纳米载体之一。NAHAR等[56]将功能化的多壁碳纳米管用于两性霉素B的靶向，发现巨噬细胞对其摄取增加，并克服了两性霉素B相关的不良反应，包括发冷、发热、恶心和剂量依赖性肾毒性等。嵌段共聚物是在水溶液中自组装的聚合物囊泡[57]，像脂质体一样，聚合体也包含水性内部，该内部通过疏水膜与外部隔开。与脂质体相比，嵌段共聚物更易于修饰，并具有更好的稳定性，适于疏水性和亲水性药物的递送[58]。LIU等[59]制备的PEG-PCL-PDEA三嵌段共聚物显示了对蛋白质极高的包封率，装载FITC-细胞色素C的嵌段共聚物囊泡可有效将蛋白质递送到RAW264.7细胞细胞质。BAGALKOT等[60]构建了带有吞噬信号的模型杂合脂质-乳胶(LiLa)纳米粒，并发现其可以优先靶向AS和脂肪组织炎症实验模型中的M1型巨噬细胞，使用PPAR-γ激动剂罗格列酮(rosiglitazone，Rosi)作为模型药物，发现LiLa纳米粒处理后细胞中Th1细胞因子(TNF-α、CCL-2和IL-6)的浓度显著降低。

3 靶向递送技术

药物递送系统(drug delivery systems，DDS)可以提高药物靶向的精确度，提高药物疗效并减小不良反应。靶向药物递送的主要方法包括主动、被动、物理化学靶向策略。被动靶向的发生是由于药物、载体在癌症或者炎症部位的微血管渗漏的患病部位产生的高渗透长滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)。除了控制载体粒子的物理化学性质以增强巨噬细胞的靶向性外，还可将配体掺入脂质体制剂中以特异性靶向细胞。目前常用两种巨噬细胞的主动靶向策略包括：靶向巨噬细胞上或巨噬细胞内的受体，以及靶向巨噬细胞分泌的或作用于巨噬细胞的细胞外信号。使用配体靶向策略进行药物递送可以增加靶标特异性，减少细胞的非特异性摄取并改变免疫细胞的反应。按照巨噬细胞发挥作用的机制，可将其分为抑制单核细胞募集、抑制巨噬细胞活化，以及调整巨噬细胞极化状态3个部分。

3.1抑制单核细胞募集 炎症状态下的肝脏、脂肪和血管内皮细胞分泌趋化因子，例如CCL2和TNF-α等，导致巨噬细胞活化和增殖，并促进其转化为M1样表型，M1型巨噬细胞会进一步表达和分泌细胞因子，例如IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS2等，加重慢性炎症和疾病进展[61]。因此可以通过干扰趋化因子信号传导来减少募集入肝脏、脂肪和血管内皮的单核细胞数量[62]。

趋化因子干扰作为治疗肝脏疾病的靶向疗法已得到深入研究，对趋化因子信号的干扰可以通过抗趋化因子或受体的单克隆抗体，受体拮抗剂，或阻断趋化因子诱导的细胞内信号传导的小分子抑制剂来实现[63]。单核细胞的招募与CCL2/CCR2及CCL1/CCR8等趋化因子与其受体的相互作用有关，CCR2和CCR5的双重抑制剂Cenicriviroc可有效阻断CCL2介导的单核细胞向肝脏的募集，并改善NASH症状[64-65]。CCR2在免疫细胞向白色脂肪组织和肝脏的募集中起着至关重要的作用，而CCR2抑制剂Propagermanium可减轻肝脏炎症和NASH的发展[66]。趋化因子CCL5/RANTES在肝炎症和纤维化的进程中起重要作用。CCL5/RANTES抑制剂Maraviroc在高脂饮食诱导的NAFLD模型中改善了肝脂肪变性[67]。这些研究表明，CCL/CCR途径与巨噬细胞募集有关，并且抑制这些途径显示出潜在的治疗作用。

在病理条件下，也可以使用对巨噬细胞产生特定毒性的分子，如双膦酸盐(氯膦酸盐和唑来膦酸)来耗竭巨噬细胞。由于炎症部位增强的血管渗透性，可以通过适当大小(直径50～100 nm)纳米载体来被动进入病理组织的渗漏血管，并在目标部位积聚。基于脂质体具有靶向单核吞噬细胞的固有特性，可以用含氯膦酸盐的脂质体，作为巨噬细胞瞬时耗竭的特定工具，一旦它们被捕获并摄入，氯膦酸盐脂质体就暴露于溶酶体磷脂酶，在磷脂双层降解之后，该溶酶体磷脂酶导致被包埋的药物在细胞质室内释放，并通过ATP依赖性机制引起细胞凋亡[68]。在AS疾病治疗中，斑块相关巨噬细胞的耗竭是减少炎症和延迟疾病进程的潜在途径。在高脂饮食动物模型中，腹膜内注射氯膦酸盐脂质体可以使ATMs耗竭，并抑制高脂诱导的体质量增加和胰岛素抵抗的发展，基因分析表明ATMs的耗竭与脂肪形成和糖异生相关基因的下调有关[69]。BIN等[70]也获得了类似的结果，在饮食诱发的肥胖小鼠中腹膜内注射氯膦酸盐脂质体可减少巨噬细胞含量，并改善全身葡萄糖稳态和胰岛素敏感性，同时胰岛素敏感性激素脂联素的血浓度升高。

3.2抑制巨噬细胞活化 通过将抗炎剂引入巨噬细胞胞质，可以调节炎性细胞因子的产生和释放[71]。具有代表性的是通过RNA干扰(RNA interference，siRNA)减少炎症基因的表达，因为可以同时下调多个炎症基因，具有相当程度的功效。潜在的靶标包括炎性递质，如细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β；趋化因子，如CCL2、CCL3、CCL5[72]；以及参与促进炎症转导的靶标，如NF-κB成员的信号转导级联[73]。

肝巨噬细胞的炎症信号转导途径，如NF-κB、ASK1、JNK等在巨噬细胞活化中发挥重要作用。LOOMBA等[74]开发了炎症信号通路凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)的抑制剂Selonsertib，治疗显示其对肝细胞代谢以及巨噬细胞活化有影响，在一项随机2期临床试验中，Selonsertib在NASH和纤维化患者中显示出纤维化、炎症以及凋亡和坏死的血清生物标志物的改善。MARADANA等[75]在患有饮食诱发的NASH的小鼠中研究发现，脂质体包裹的亲脂性姜黄素或骨化三醇，姜黄素和骨化三醇都是NF-κB抑制剂，包裹二者的脂质体被肝巨噬细胞和树突状细胞摄取后抑制了肝炎症、脂肪堆积、纤维化和胰岛素抵抗。AOUADI等[76]使用β1，3-D-葡聚糖包裹的siRNA颗粒作为有效的口服递送载体，该载体可能使小鼠巨噬细胞中的促分裂原激活的丝裂原激活蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4，Map4k4)基因沉默，进而抑制TNF-α和IL-1β等炎症因子的产生，保护动物免受脂多糖诱导的致死性。WANG等[77]将抗氧化剂共价缀合到环状多糖β-环糊精上得到抗氧化纳米粒，发现巨噬细胞和血管平滑肌细胞可以高效、快速地内化纳米粒，并通过抑制ROS、TNF-α、IL-1β和MCP-1等促炎因子的分泌减轻炎症因子诱导的巨噬细胞炎症和细胞凋亡，并有效抑制泡沫细胞形成，改善ApoE-/-小鼠AS发展。

3.3调整巨噬细胞极化状态

3.3.1糖基化受体 巨噬细胞表面表达甘露糖受体(mannose receptors，MR)和半乳糖C型凝集素1/2(macrophage galactose-type c-type lectin 1/2，Mgl1/2)等C型凝集素受体，可以通过受体介导的内吞作用使递送系统内在化，有利于糖基化药物递送[78-79]，常用于靶向癌症中的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)。甘露糖受体是一种在巨噬细胞上高表达的内吞蛋白，而Mgl1/2与寄生虫感染中M2巨噬细胞分化有关。NASH疾病中的KCs可被甘露糖受体靶向极化为促炎表型[80]。

甘露糖基化脂质体已多次被证明优先靶向巨噬细胞，与未连接甘露糖的对照组相比，甘露糖基化的脂质体与巨噬细胞的结合显著增加[81]。HE等[82]构建了可以口服的甘露糖修饰的三甲基壳聚糖-半胱氨酸缀合的纳米粒来包载小干扰RNA，在体内实验中，这些纳米粒通过甘露糖受体被巨噬细胞特异性摄取，有效抑制了巨噬细胞中 TNF-α的产生，减少了小鼠的炎症引起的肝损害和致死性。连接甘露糖配体并包裹CD163基因的聚乙烯亚胺纳米粒可以靶向单核细胞，特别是M1型巨噬细胞，从而将M1巨噬细胞转化为M2巨噬细胞，并释放抗炎因子以减轻炎症性疾病的进展[83]。

与此同时，AS病变中也同时存在着M2型巨噬细胞，其表型与斑块稳定性相关，笔者很少见到有研究专门关注M2型巨噬细胞在AS发病机制中的作用，但由于FR表达与巨噬细胞活化和M2分化有关，因此探索AS病变部位的FR阳性巨噬细胞与斑块稳定性的关系，有利于构建以FR为靶标的药物来治疗AS中的不稳定斑块[89]。另外，在TAMs中也检测到FR-β表达，这些巨噬细胞表现出M2样功能，并在肿瘤环境中发挥强大的免疫抑制功能[90]。因此，基于叶酸的载体可能将药物递送至活化的巨噬细胞而作为炎症疾病和癌症的潜在免疫治疗工具。

3.3.3F4/80 F4/80糖蛋白是小鼠巨噬细胞最特异的细胞表面标志物之一，它在大多数常驻组织巨噬细胞中高度组成性表达，包括脾脏中的红髓巨噬细胞，脑中的小胶质细胞，肝中的KCs等，而血液中的单核细胞表达的F4/80比成熟的巨噬细胞要少[91]。小鼠的F4/80抗原由Adgre1基因座编码，而在人类中Adgre1基因mRNA在嗜酸性粒细胞高度表达[92]。F4/80 单克隆抗体的产生和应用极大地有益于小鼠组织巨噬细胞的表型鉴定[93]。LAROUI等[94]将TNF-αsiRNA加载到由聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(PLA-PEG)制成的纳米粒中，并将F4/80 抗体的Fab'部分通过马来酰亚胺/巯基基团介导的共价键结合到纳米粒表面，发现该纳米粒可以与RAW264.7细胞直接结合，显著改善在体外对RAW264.7细胞的巨噬细胞靶向动力学。而动物实验表明，连接F4/80 抗体的Fab'部分的纳米粒可以更有效地减轻小鼠3%右旋糖酐硫酸钠的结肠炎。

3.3.4清道夫受体(scavenger receptors，SRs) SRs是与结构无关的膜受体，在巨噬细胞、小胶质细胞和树突状细胞上高度表达，它们广泛地识别并摄取具有负电荷的粒子。SRs是一种病原体受体，能够结合病原体和自身来源的靶向配体，并通过氧化和乙酰化识别修饰的LDL[95]。

在AS斑块形成过程中，糖蛋白CD36起着非常重要的作用。CD36是清道夫受体B类成员，在巨噬细胞、单核细胞、血小板和内皮细胞均有表达。通过在ApoE缺陷型小鼠中的研究，已经清楚地确定了其在AS中的重要性，CD36失活可以显著缩小病变部位。因此可以利用CD36配体，如GHRPs蛋白家族的海沙瑞林(hexarelin)，来靶向在AS病变中高表达CD36的巨噬细胞[96]。

CD163也属于SRs，仅表达在单核细胞谱系中，并优先在M2型以及TAMs巨噬细胞中表达[97]。巨噬细胞活化后，CD163以可溶形式(solubleCD163，sCD163)脱落并进入循环，可作为巨噬细胞活化的生化标记[98]。sCD163的升高与肝脏炎症、纤维化等肝病的发展和并发症[99]，以及胰岛素抵抗和T2D有关[100]。KAZANKOV等[101]研究发现，sCD163的表达也与NASH和NAFLD的严重程度相关。ETZERODT等[97]设计了连接CD163单克隆抗体的聚乙二醇涂层脂质体，称为“隐性脂质体”，发现连接CD163抗体可显著增加CD163转染的细胞和巨噬细胞对隐性脂质体的特异性摄取。GRAVERSEN 等[102]开发了2种可生物降解的CD163抗体-药物偶联物脂质体，分别将药物直接连接至CD163抗体，以及将药物包裹在表面连接CD163抗体的脂质体中，在大鼠炎症模型中使用该脂质体包裹合成地塞米松后，其功效可提高50倍，同时几乎没有全身性糖皮质激素不良反应，包括骨骼动员、肌肉质量下降、感染和代谢改变等。SVENDSEN等[103]使用CD163抗体与地塞米松的结合物来治疗果糖诱导的NASH，发现小剂量即可显著减少炎症、肝细胞膨胀、纤维化和糖原沉积，并且没有出现明显的全身性不良反应，而没有结合CD163抗体的地塞米松在小剂量情况下则没有这种作用。

5 讨论

随着对巨噬细胞在传染病、炎性疾病、癌症和代谢性疾病等多种疾病中的作用有更多的研究，人们对巨噬细胞的重要性有了进一步的认识，针对巨噬细胞的靶向策略在研究和临床中也变得越来越重要。连接配体的靶向疗法已成为克服常规药物缺乏特异性的一种方法。特定于巨噬细胞的靶向药物递送可将药物特异性输送到巨噬细胞表面或内部，从而减少药物进入其他非靶细胞，增加治疗效果，并减小与药物有关的毒性。尽管靶向载体具有很多益处，但仍有许多困难需要克服，例如口服生物利用度不高、循环不稳定、组织分布不充分、成本偏高以及毒性等，这些都限制了巨噬细胞靶向载体在临床的应用。另外，未来也需要增加对巨噬细胞靶向载体的长期毒性研究，以及在动物模型上的临床前研究，并增加长期存储稳定性，进而推进靶向药物递送的发展与应用。