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益肾补骨汤调节去卵巢大鼠骨代谢的作用研究

2021-07-05刘雯侯晨辉李江

中国骨质疏松杂志 2021年6期
关键词:尼尔骨组织骨密度

刘雯 侯晨辉 李江

1 郑州铁路职业技术学院护理学院,河南 郑州 451460

2 河南省天然药物提取和医疗技术应用工程研究中心,河南 郑州 451460

据统计,我国骨质疏松症患者已超9 000万,其中约60 %~70 %为绝经后妇女[1]。目前治疗绝经后骨质疏松症的药物有生长激素类药物、氟化物等,此类药物虽然可调节骨代谢,但副作用明显[2]。有文献[3]报道益肾补骨汤对骨质疏松症有效且安全。BMP/Smads通路在骨形成过程中发挥重要的调控作用,BMP-2可通过Smads调控下游靶基因Runx 2,Runx 2是成骨细胞特异性转录因子,促进骨形成[4];OPG/RANKL/RANK则是骨吸收的经典调控通路,可抑制破骨细胞的活性,减少骨吸收[5]。本研究将基于上述通路,研究益肾补骨汤对去卵巢大鼠骨代谢的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

61只8~10周龄SPF级SD雌鼠,体重180~200 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0001];尼尔雌醇购自廊坊高博京邦制药有限公司(20160428);中药材均购自同仁堂大药房;大鼠血清BALP(20180805)、BGP(20180121)、PINP(20161114)、TPACP5b(20180215)、NTX-Ⅰ(20180314)试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司;HE染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(20180624);RNA提取试剂盒及反转录试剂盒均购自美国Promega公司(20 160 620 A、20170518B);实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)预混液购自美国RBGPhe公司(Y161121);NMP-2(180528)、Smad-1/5/8(170630)、磷酸化Smad-1/5/8(p-Smad1/5/8,181205)、Runx 2(170712)、OPG(190415)、RANKL(181113)、RANK(181012)一抗及二抗均购自美国Cell Signaling公司;引物合成委托苏州金唯智生物科技有限公司进行。

Mk3酶标仪购自美国Thermo Fisher公司;MM-7金相光学显微镜购自上海光学仪器一厂;RZ-Digumus小动物双能X线骨密度仪购自美国Kubtec公司(精确度误差为 1.5%);HHQ-3558石蜡切片机购自杭州艾普仪器设备有限公司;165-8001小型垂直电泳仪购自美国伯乐公司;7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1益肾补骨汤制备:中药材经过鉴定,按方称取,常规水煎后去渣取汁,每毫升分别含生药1.34、2.68、5.36 g,经指纹图谱鉴定符合标准[6]。

1.2.2建模及分组:随机取51只大鼠建立去卵巢大鼠模型。经腹腔麻醉,暴露大鼠双侧卵巢组织并切除。余下10只记作假手术组,不切除卵巢。两个月后,于建模大鼠中随机选1只取其右侧胫骨,实施HE染色,病理评分若≥2分则认为建模成功,其中基本正常、偶见轻微病变、病变范围≤1/4视野、>1/4视野且≤1/2视野、>1/2视野分别记为0、1、2、3、4分。将建模大鼠随机分为5组,其中尼尔雌醇组给予1.5 mg/kg尼尔雌醇(溶于1 mL/100 g生理盐水)灌胃,高剂量益肾补骨汤组给予高剂量(含生药5.36 g/mL)益肾补骨汤1 mL/100 g灌胃,中剂量益肾补骨汤组给予中剂量(含生药2.68 g/mL)益肾补骨汤1 mL/100 g灌胃,低剂量益肾补骨汤组给予低剂量(含生药1.34 g/mL)益肾补骨汤1 mL/100 g灌胃,模型组和假手术组均给予1 mL/100 g生理盐水灌胃,每日1次,连续3个月。采用双能X线骨密度仪检测大鼠股骨、胫骨骨密度(bone mineral density, BMD)值;采用酶联免疫法检测试剂盒测得大鼠尾静脉血血清骨代谢水平。

1.2.3大鼠骨组织骨代谢相关基因表达水平检测:取大鼠左侧胫骨组织,使用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒提取胫骨中总RNA并将其反转录为cDNA。根据NCBI上查询的基因序列,设计出上下游引物。退火温度为56 ℃,35个循环,计算2-△△Ct。

1.2.4大鼠骨组织骨代谢相关蛋白表达及p-Smad1/5/8水平检测:取大鼠左侧胫骨组织,研磨加入细胞裂解液。蛋白上样,凝胶电泳,转膜后封闭2 h,加入一抗4 ℃孵育过夜,更换二抗,室温孵育2 h。显色、分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 模型验证

建模大鼠胫骨组织HE染色病理评分为4分,表明建模成功,见图1。

图1 建模大鼠胫骨组织骨小梁HE染色(×200)

2.2 各组大鼠骨密度对比

模型组骨密度低于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组的骨密度均高于模型组(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠骨密度对比

2.3 各组大鼠骨代谢指标对比

治疗后模型组血清BALP、BGP和PINP水平均低于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均高于模型组(P<0.05);模型组TPACP5b和NTX-I水平均高于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于模型组(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠骨代谢指标对比

2.4 大鼠骨组织形态学观察

假手术组胫骨骨细胞排列有序,骨小梁结构完整,排列规整;模型组骨内胶原纤维明显紊乱,骨小梁变细,数量减少,并出现断裂;尼尔雌醇组和益肾补骨汤高、中、低剂量组均出现好转,其中益肾补骨汤高剂量组骨胶原纤维排列较整齐,骨小梁厚度、骨连续性均与假手术组较为接近,见图2。

图2 各组大鼠骨组织形态学观察(HE,×40)

模型组病理评分高于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于尼尔雌醇组(P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠骨组织病理评分对比

2.5 大鼠骨组织相关基因表达对比

大鼠骨组织BMP-2、Smad-1/5/8、Runx 2、OPG mRNA表达水平比较:模型组低于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均高于模型组(P<0.05);模型组RANKL、RANL mRNA表达均高于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于模型组(P<0.05),见表4。

表4 各组大鼠骨组织相关基因表达对比

2.6 大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平对比

模型组BMP-2、Smad-1/5/8、Runx2、OPG蛋白表达及p-Smad1/5/8水平均低于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均高于模型组(P<0.05);模型组RANKL、RANL 蛋白表达均高于假手术组(P<0.05),尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于模型组(P<0.05)。见图3、表5。

表5 大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平比较

图3 大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平检测(WB)

3 讨论

中医认为骨质疏松症是由肝肾亏虚、瘀血阻滞所致。益肾补骨汤主要成分有黄芪、鹿角霜、葛根、当归、淫羊藿等。黄芪可补气固表;鹿角霜可温肾助阳;葛根可升阳解热;当归可益气健脾,活血化瘀;淫羊藿可补肾阳,强筋骨。主要联用可补肾健脾、活血化瘀、强筋健骨[7]。因此本研究观察益肾补骨汤治疗去卵巢大鼠骨代谢水平具有可行性。

BALP可以反映成骨细胞活性,有研究[8]表明,绝经后骨质疏松女性血清检测到BALP水平降低;BGP由成骨细胞分泌,是反应成骨细胞功能的标志物[9];PINP源于Ⅰ型前胶原,是Ⅰ型胶原蛋白合成过程中从Ⅰ型前胶原上剪切的产物,可反映Ⅰ型胶原蛋白合成水平和新骨形成水平[10];TPACP5b主要由破骨细胞分泌,可抵抗酒石酸抑制[11];NTX-I是胶原降解标志物,其水平与骨吸收活性呈正相关[12]。本研究结果显示,益肾补骨汤可改善骨代谢水平,还可减轻骨组织病变。

BMP-2属于TGF-β超家族成员,正常情况下在骨组织中高表达。Smad1/5/8是BMP下游信号分子。当BMP信号被激活时会将下游Smad1/5/8磷酸化,引起p-Smad1/5/8核位移,进一步调控下游靶基因Runx 2表达水平[13]。Runx 2基因表达与骨基质蛋白形成有关,有研究[14]发现,转染Runx 2基因可导致骨形成指标水平均上调。OPG又称为破骨细胞抑制因子,属于肿瘤坏死因子受体家族成员,其活性下降意味着对破骨细胞活性的抑制作用减弱,可增加骨吸收,同时其下游的RANKL、RANK活性增强,放大破骨细胞的生物学活性,进而增加骨吸收[15]。本研究结果发现,益肾补骨汤可上调骨组织BMP-2、Smad-1/5/8、Runx 2、OPG mRNA和蛋白表达水平,增加p-Smad1/5/8水平升高,还可下调RANKL、RANK表达,推测是通过调控BMP/Smads通路和OPG/RANKL/RANK通路实现对骨代谢的调节作用的。

综上所述,益肾补骨汤可增强去卵巢大鼠骨密度,改善骨组织病变,推测其机制可能与调控BMP/Smads通路和OPG/RANKL/RANK通路有关。

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