益肾补骨汤调节去卵巢大鼠骨代谢的作用研究

刘雯 侯晨辉 李江

1 郑州铁路职业技术学院护理学院，河南 郑州 451460

2 河南省天然药物提取和医疗技术应用工程研究中心，河南 郑州 451460

据统计，我国骨质疏松症患者已超9 000万，其中约60 %～70 %为绝经后妇女[1]。目前治疗绝经后骨质疏松症的药物有生长激素类药物、氟化物等，此类药物虽然可调节骨代谢，但副作用明显[2]。有文献[3]报道益肾补骨汤对骨质疏松症有效且安全。BMP/Smads通路在骨形成过程中发挥重要的调控作用，BMP-2可通过Smads调控下游靶基因Runx 2，Runx 2是成骨细胞特异性转录因子，促进骨形成[4]；OPG/RANKL/RANK则是骨吸收的经典调控通路，可抑制破骨细胞的活性，减少骨吸收[5]。本研究将基于上述通路，研究益肾补骨汤对去卵巢大鼠骨代谢的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

61只8～10周龄SPF级SD雌鼠，体重180～200 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0001]；尼尔雌醇购自廊坊高博京邦制药有限公司(20160428)；中药材均购自同仁堂大药房；大鼠血清BALP(20180805)、BGP(20180121)、PINP(20161114)、TPACP5b(20180215)、NTX-Ⅰ(20180314)试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司；HE染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(20180624)；RNA提取试剂盒及反转录试剂盒均购自美国Promega公司(20 160 620 A、20170518B)；实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)预混液购自美国RBGPhe公司(Y161121)；NMP-2(180528)、Smad-1/5/8(170630)、磷酸化Smad-1/5/8(p-Smad1/5/8，181205)、Runx 2(170712)、OPG(190415)、RANKL(181113)、RANK(181012)一抗及二抗均购自美国Cell Signaling公司；引物合成委托苏州金唯智生物科技有限公司进行。

Mk3酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；MM-7金相光学显微镜购自上海光学仪器一厂；RZ-Digumus小动物双能X线骨密度仪购自美国Kubtec公司(精确度误差为 1.5%)；HHQ-3558石蜡切片机购自杭州艾普仪器设备有限公司；165-8001小型垂直电泳仪购自美国伯乐公司；7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1益肾补骨汤制备：中药材经过鉴定，按方称取，常规水煎后去渣取汁，每毫升分别含生药1.34、2.68、5.36 g，经指纹图谱鉴定符合标准[6]。

1.2.2建模及分组：随机取51只大鼠建立去卵巢大鼠模型。经腹腔麻醉，暴露大鼠双侧卵巢组织并切除。余下10只记作假手术组，不切除卵巢。两个月后，于建模大鼠中随机选1只取其右侧胫骨，实施HE染色，病理评分若≥2分则认为建模成功，其中基本正常、偶见轻微病变、病变范围≤1/4视野、>1/4视野且≤1/2视野、>1/2视野分别记为0、1、2、3、4分。将建模大鼠随机分为5组，其中尼尔雌醇组给予1.5 mg/kg尼尔雌醇(溶于1 mL/100 g生理盐水)灌胃，高剂量益肾补骨汤组给予高剂量(含生药5.36 g/mL)益肾补骨汤1 mL/100 g灌胃，中剂量益肾补骨汤组给予中剂量(含生药2.68 g/mL)益肾补骨汤1 mL/100 g灌胃，低剂量益肾补骨汤组给予低剂量(含生药1.34 g/mL)益肾补骨汤1 mL/100 g灌胃，模型组和假手术组均给予1 mL/100 g生理盐水灌胃，每日1次，连续3个月。采用双能X线骨密度仪检测大鼠股骨、胫骨骨密度(bone mineral density, BMD)值；采用酶联免疫法检测试剂盒测得大鼠尾静脉血血清骨代谢水平。

1.2.3大鼠骨组织骨代谢相关基因表达水平检测：取大鼠左侧胫骨组织，使用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒提取胫骨中总RNA并将其反转录为cDNA。根据NCBI上查询的基因序列，设计出上下游引物。退火温度为56 ℃，35个循环，计算2-△△Ct。

1.2.4大鼠骨组织骨代谢相关蛋白表达及p-Smad1/5/8水平检测：取大鼠左侧胫骨组织，研磨加入细胞裂解液。蛋白上样，凝胶电泳，转膜后封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，更换二抗，室温孵育2 h。显色、分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 模型验证

建模大鼠胫骨组织HE染色病理评分为4分，表明建模成功，见图1。

图1 建模大鼠胫骨组织骨小梁HE染色(×200)

2.2 各组大鼠骨密度对比

模型组骨密度低于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组的骨密度均高于模型组(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠骨密度对比

2.3 各组大鼠骨代谢指标对比

治疗后模型组血清BALP、BGP和PINP水平均低于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均高于模型组(P<0.05)；模型组TPACP5b和NTX-I水平均高于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠骨代谢指标对比

2.4 大鼠骨组织形态学观察

假手术组胫骨骨细胞排列有序，骨小梁结构完整，排列规整；模型组骨内胶原纤维明显紊乱，骨小梁变细，数量减少，并出现断裂；尼尔雌醇组和益肾补骨汤高、中、低剂量组均出现好转，其中益肾补骨汤高剂量组骨胶原纤维排列较整齐，骨小梁厚度、骨连续性均与假手术组较为接近，见图2。

图2 各组大鼠骨组织形态学观察(HE，×40)

模型组病理评分高于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于尼尔雌醇组(P<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠骨组织病理评分对比

2.5 大鼠骨组织相关基因表达对比

大鼠骨组织BMP-2、Smad-1/5/8、Runx 2、OPG mRNA表达水平比较：模型组低于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均高于模型组(P<0.05)；模型组RANKL、RANL mRNA表达均高于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于模型组(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠骨组织相关基因表达对比

2.6 大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平对比

模型组BMP-2、Smad-1/5/8、Runx2、OPG蛋白表达及p-Smad1/5/8水平均低于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均高于模型组(P<0.05)；模型组RANKL、RANL 蛋白表达均高于假手术组(P<0.05)，尼尔雌醇组和益肾补骨汤三个剂量组均低于模型组(P<0.05)。见图3、表5。

表5 大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平比较

图3 大鼠骨组织相关蛋白表达及磷酸化水平检测(WB)

3 讨论

中医认为骨质疏松症是由肝肾亏虚、瘀血阻滞所致。益肾补骨汤主要成分有黄芪、鹿角霜、葛根、当归、淫羊藿等。黄芪可补气固表；鹿角霜可温肾助阳；葛根可升阳解热；当归可益气健脾，活血化瘀；淫羊藿可补肾阳，强筋骨。主要联用可补肾健脾、活血化瘀、强筋健骨[7]。因此本研究观察益肾补骨汤治疗去卵巢大鼠骨代谢水平具有可行性。

BALP可以反映成骨细胞活性，有研究[8]表明，绝经后骨质疏松女性血清检测到BALP水平降低；BGP由成骨细胞分泌，是反应成骨细胞功能的标志物[9]；PINP源于Ⅰ型前胶原，是Ⅰ型胶原蛋白合成过程中从Ⅰ型前胶原上剪切的产物，可反映Ⅰ型胶原蛋白合成水平和新骨形成水平[10]；TPACP5b主要由破骨细胞分泌，可抵抗酒石酸抑制[11]；NTX-I是胶原降解标志物，其水平与骨吸收活性呈正相关[12]。本研究结果显示，益肾补骨汤可改善骨代谢水平，还可减轻骨组织病变。

BMP-2属于TGF-β超家族成员，正常情况下在骨组织中高表达。Smad1/5/8是BMP下游信号分子。当BMP信号被激活时会将下游Smad1/5/8磷酸化，引起p-Smad1/5/8核位移，进一步调控下游靶基因Runx 2表达水平[13]。Runx 2基因表达与骨基质蛋白形成有关，有研究[14]发现，转染Runx 2基因可导致骨形成指标水平均上调。OPG又称为破骨细胞抑制因子，属于肿瘤坏死因子受体家族成员，其活性下降意味着对破骨细胞活性的抑制作用减弱，可增加骨吸收，同时其下游的RANKL、RANK活性增强，放大破骨细胞的生物学活性，进而增加骨吸收[15]。本研究结果发现，益肾补骨汤可上调骨组织BMP-2、Smad-1/5/8、Runx 2、OPG mRNA和蛋白表达水平，增加p-Smad1/5/8水平升高，还可下调RANKL、RANK表达，推测是通过调控BMP/Smads通路和OPG/RANKL/RANK通路实现对骨代谢的调节作用的。

综上所述，益肾补骨汤可增强去卵巢大鼠骨密度，改善骨组织病变，推测其机制可能与调控BMP/Smads通路和OPG/RANKL/RANK通路有关。