肝豆灵干预肝豆状核变性骨代谢障碍的疗效观察

李祥 程婷 汪瀚 汪美霞 杨文明 胡建鹏

1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038

2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

3.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038

4.安徽医科大学临床医学院，安徽 合肥 230012

肝豆状核变性(Wilson disease，WD)是一种神经系统常染色体隐性遗传病，主要病理特点为铜代谢异常，是全球为数不多的能够进行有效诊治的遗传疾病。在骨骼、肝、角膜、心脏、脑及肾等组织器官内会积聚过多的铜，产生骨关节损伤、肝硬化、角膜K-F环、心功能损伤、椎体外系症状等临床表现[1]。现代医学对WD的肝脏、大脑等脏器和组织受损的病因病理、临床研究关注颇高，有研究显示WD骨骼肌病变误诊率高达10 %，占比超过该病总误诊率的1/4，常因误诊误治加重病情[2]。有关文献显示WD骨关节损害的发生率为18 %～80 %不等，表明WD的骨关节损害并非罕见，临床上应重视该病的骨代谢障碍症状。相关专家将文献资料归纳总结后得出WD患者广泛存在骨关节损伤，都有一定程度骨质疏松、骨密度下降等变化，容易导致软骨炎、骨关节炎、骨质碎片化、关节钙化灶、局限性脱矿物质、骨畸形、骨折等[3-4]。本团队前期大量的临床和基础研究显示肝豆灵片可以有效改善肝豆状核变性病情，且不良反应较小。现观察比较肝豆灵片治疗WD骨代谢障碍患者前后临床症状、细胞因子及骨代谢生化指标的变化，探讨肝豆灵片疗效和WD骨代谢障碍可能机制，为本病诊断和治疗提供一定借鉴。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2018年3月至2018年10月入住我院脑病三科符合WD纳入标准的44例患者病例资料，男11例，女23例，年龄10～40岁，平均(21.5±8.0)岁；病程6～360个月，平均(82.1±80.8)个月。44例WD患者中15例出现了腕、踝、膝、髋关节程度不一的疼痛；6例伴发不同程度的关节畸形，以双下肢、双前臂远端或末端明显，日常活动较受限；10例患者常常自觉双前臂、双下肢乏力明显；13例患者无明显骨代谢障碍不适症状。另有30例体健的志愿人员加入本研究(健康组)，有12例男性，18例女性，平均年龄为(24.0±7.1)岁。在年龄及性别等层面，治疗组与健康组没有明显差别，可以进行对比。在整个研究中没有一个受试者中途脱落，入组的全部病例都顺利完成治疗。

1.2 诊断标准与中医辨证分型诊断标准

1.2.1WD西医诊断标准[5]：①有肝病病史或椎体外系病史，或者同时具有以上两种病史；②血清铜蓝蛋白明显下降；③眼科会诊提示角膜K-F环(+)；④亲属患有或曾患有WD，有家族史。①、②为确诊的必备条件，再加上③、④中任何一条就可确诊。

1.2.2骨代谢障碍的诊断标准(Z值)[6]：①骨量低：Z小于-2；②骨量减少：骨密度值下降1至2.5个标准差；③骨质疏松：骨密度至少下降2.5个标准差；④严重骨质疏松：除了满足第③外，还需伴有至少一处骨折。以上骨密度值均与同性别且同种族的正常成人骨峰值比较，出现以上任一征象者示为异常。

1.2.3WD中医证候诊断标准[7]：当痰瘀互结证与肝肾亏虚证二者的中医证候积分值≥20分时，可以确诊[8]。

1.2.4纳入标准：①经西医诊断，确诊为WD及骨代谢障碍；②经中医诊断，确诊为肝肾亏虚型或痰瘀互结型；③年龄10～40岁(不包括10岁和40岁)；④通过安徽中医药大学第一附属医院医学伦理委员会审核，受试者或监护人自愿签署知情同意书；⑤就医前2周没有进行任何专业系统的驱铜治疗，同时未有其他影响骨代谢的疾病服药史，未有骨质疏松、骨折等病史。

1.2.5排除、脱落标准：①年龄小于等于10岁或大于等于40岁；②就诊前2周已使用明确影响代谢的药物；③没有依据规定诊治没有办法判定治疗效果的患者；没有按时定期随访者。在分析病例时将脱落病例剔除，不进行分析。

1.3 治疗方法

1.3.1入组44例患者及30例体健的志愿人员均于入组次日早晨空腹采静脉血6 mL，经离心机(金坛市精达仪器制造有限公司，型号：精达80-2)离心(3 500 r/min，15 min)后，取上层血清3 mL置于-20 ℃冰箱中保存。采集后进行血清铜、铜蓝蛋白、铜氧化酶、生化、UWDRS评分、中医证候积分、双能X骨密度(含双前臂、双股骨、腰椎L1-L4)测定，骨转化生化标志物及细胞因子指标检测。另嘱患者入院次日早晨7时排空尿液，留取24 h尿液并记录总量，取5 mL检测，4个治疗周期后复查24 h尿铜。

1.3.244例患者均在入院后进行中医望、闻、问、切，详细采集患者症状、体征、舌苔、脉象，按照诊断标准进行辨证分型、临床分型。①基础治疗：DMPS 20 mg/(kg·d)(规格0.125 g/2 mL，批号：120903，上海禾丰制药有限公司)溶于5 %葡萄糖注射液250 mL缓慢静滴 qd，连续6 d为1个疗程，每个疗程之间间隔2 d。同一时间口服1# qd、4个疗程的钙尔奇碳酸钙D3片(江苏惠氏制药有限公司，国药准字 H10950029，规格：每片包含600 mg的钙与125 IU的维生素D3)。②肝豆灵组：在基础治疗的同时服用肝豆灵(安徽省中医院制剂中心提供，经该院主管药师苌凤锦鉴定为正品，由大黄、丹参、莪术、金钱草等组成)，早晚各150 m L温服，连续4个疗程。

1.4 观察指标及方法

观察治疗前后血Ca、1,25-(OH)2D3、BGP、BAP、IL-4、IL-10、TNF-α、IGF-1，比较治疗前后24 h尿铜、UWDRS评分、中医证候积分，观察不良反应等。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 健康受试者与 WD骨代谢障碍患者骨代谢、细胞因子指标比较

健康受试者与WD骨代谢障碍患者血Ca、1,25-(OH)2D3、BGP、BAP、IL-4、IL-10、TNF-α、IGF-1比较。见表1。

表1 健康受试者与 WD骨代谢障碍患者骨代谢、细胞因子指标比较

根据表1可以看出：WD组病患的IGF-1、IL-10、1,25-(OH)2D3及血Ca水平比健康组显著减少，且两组程度比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.2 WD骨代谢障碍患者两组治疗前后骨代谢生化指标、细胞因子指标变化

WD骨代谢障碍患者两组治疗前后骨代谢生化指标、细胞因子指标变化，见表2。

表2 两组治疗前后骨代谢生化指标、细胞因子指标变化

表2数据提示，两组组内进行对比，对照组在治疗后血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1水平与治疗前相比显著提高，差异具有统计学意义(P<0.01)；IL-4与治疗前相比减少并差异具有统计学意义(P<0.01)；BGP、BAP、TNF-α与诊治前相比均减少，IL-10与诊治前相比有所升高，但差异没有统计学意义(P>0.05)。肝豆灵组疗后血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1较疗前升高，IL-4、BGP、BAP、TNF-α均较疗前降低，差异均有显著统计学意义(P<0.01)；IL-10较疗前升高，差异无统计学意义(P>0.05)。两组疗后比较，肝豆灵组血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1、IL-4、BGP、BAP、TNF-α变化均较对照组差异有显著统计学意义(P<0.01)。

2.3 WD骨代谢障碍患者两组治疗前后UWDRS评分、中医证候积分、尿铜值比较

WD骨代谢障碍患者两组治疗前后UWDRS评分、中医证候积分、尿铜值比较，见表3～表5。

表3 两组UWDRS分值变化分)

表4 两组中医证候积分变化分)

表5 两组24 h尿铜变化

表3数据提示，4个周期后两组患者的UWDRS分数均小于诊治前，变化程度差异具有统计学意义(P<0.01)，肝豆灵组UWDRS分数与对照组进行比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。

表4数据提示，4个周期后两组患者的中医证候分数和诊治前相比均有减少，变化程度差异具有统计学意义(P<0.01)，肝豆灵组中医证候积分与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

表5数据提示，4个周期后两组患者的24 h尿铜值和诊治前相比均有减少，变化程度差异具有统计学意义(P<0.01)，肝豆灵组24 h尿铜值与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.4 WD骨代谢障碍患者两组治疗期间不良反应的观察

WD骨代谢障碍患者两组治疗期间的不良反应，见表6。

表6 两组不良反应发生情况比较(n)

表6显示，两组治疗过程中均有不良反应出现，以低热、皮疹出现比例最高，肝豆灵组不良反应发生率(11.11 %)明显低于对照组(23.07 %)。

3 讨论

综合文献分析得出骨质疏松症、佝偻病、早期骨关节炎、骨质软化、骨畸形等是WD骨代谢障碍的常见特征，但目前临床上这种临床表现很少引起医生重视，误诊率较高。2009年WD全球评估量表，把骨骼和肌肉损伤表现列为诊断WD四个主要症状群之一[9]。Bhatnagar等[10]报告一位患有股骨颈病理性骨折3个月的12岁女孩，后诊断为WD。因此如果儿童或青少年出现无法解释的肌肉骨骼问题，应考虑该病。骨密度约反映骨强度的70 %，WD其生物化学特征是各种组织器官中细胞内铜浓度的增加，WD合并骨质疏松的特征是骨密度减低、微结构退化和骨折风险增加。WD骨代谢障碍患者如果长期得不到正确诊治，可引起骨骼肌肉系统的不可逆损伤，对患者造成肢体功能残障等严重不良后果，因此对于WD合并骨代谢障碍早期诊断并予以有效治疗尤为关键和必要，有利于防止进一步的功能障碍。

人体vitD2、vitD3 在体内氧化形成25-(OH)D3后变化成具有完全活性的1,25-(OH)2D3。本研究发现WD患者血Ca和1,25-(OH)2D3较健康组明显减低，推测很大程度上由于体内的羟化酶活性降低导致WD患者1,25-(OH)2D3合成不足。WD中的游离铜毒性较大，可能增加氧化应激标志物的应激性增高，产生细胞组织器官的毒性损伤，氧化应激的增加可能会导致炎症细胞因子在死亡信号的级联传导活动[11]。IL-4主要由活化的T细胞、肥大细胞产生，可通过抑制OC前体转化为OC，从而发挥抑制骨破坏作用。IL-10作为细胞因子中的干扰素家族功能比较多的一类负性调节因子，可以明显地抑制Th1细胞产生IFN-γ和IL-2等，能够明显减少破骨细胞的聚合性以及活化程度。TNF-α的生物活性十分活跃，在某角度上可以加快骨吸收，加快骨相关细胞凋亡速度。骨碱性磷酸酶(BAP)、骨羧基谷氨酸蛋白(BGP)直接反映骨密度、微结构退化程度。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)作为活性蛋白多肽物质，有着加快骨的合成代谢，确保体内正常结构功能不受到影响的作用，增大成骨细胞的碱性磷酸酯酶的活性程度[12]。本研究发现WD骨代谢障碍患者骨密度异常，临床骨关节损害表现不一，其血清BGP、BAP、IL-4、TNF-α水平升高，IL-10、IGF-1水平降低。通过肝豆灵片治疗后上述骨代谢指标和细胞炎性因子均有变化，其中血Ca、1,25-(OH)2D3、IGF-1较治疗前升高，IL-4、BGP、BAP、TNF-α均较治疗前降低，表明肝豆灵片可影响肝豆状核变性患者体内细胞因子和炎性介质。

肝豆灵是依据新安医学脑病方面特有的中药方剂理论和特色，创制的特色院内制剂。方中郁金芳香疏肝、解郁化浊、清心凉血；姜黄活血行气；黄连清湿热；莪术活血行气；丹参、鸡血藤活血养血，通经利络；大黄清热解毒、通腑利湿；诸药合理搭配，共奏活血化瘀、疏肝利胆、祛痰排铜之功。现代药理研究发现郁金具有抗炎止痛，减轻炎性反应的作用[13]；姜黄具有抑制肾组织氧化损伤，保护肾脏结构的作用[14]；莪术能抑制血管内皮生长因子的表达，降低尿酸、尿素等，减轻肾组织的纤维化进展程[15-16]；丹参酮ⅡA能抑制肾氧化应激反应，延缓肾组织损伤作用[17]；金钱草是保护治疗肾脏疾病的重要中药之一，具有降低血尿素和多种氨基酸的含量, 逆转部分肾损伤潜在标志物的相对含量，可能与金钱草总黄酮抑制肾损伤氧化应激和抑制骨桥蛋白的表达有关[18]；泽泻能抑制肾小球损伤，减轻肾小管变性，抑制肾炎、肾病综合征等并发症的发生[19]。

肝豆状核变性属于遗传性疾病，中医认为遗传性疾病本质是先天肾精不足，肾的“藏精，主生长、发育、生殖”功能受损。WD病机是先天肾精不足，加上铜毒侵袭，导致肝、脾等脏器受损，最终表现为肝、脾、肾俱虚的临床症状[20]。本研究提示肝豆灵片能够对肝豆状核变性骨代谢障碍具有调节的作用，经过对细胞因子介导的炎症反应的影响，从而对肝豆状核变性患者的骨代谢受损有着治疗效果，可以在临床中推广使用。