斑马鱼骨质疏松模型的研究应用

王曦悦 张秀艳 董馨 马飞祥 刘杰 乔俊缠 薛培凤*

1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010000

2.内蒙古自治区呼和浩特市蒙中医院药剂科，内蒙古 呼和浩特 010000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由于多种原因引起的骨量丢失与降低、骨组织微结构破坏、骨脆性增加、骨密度(bone mineral density，BMD)下降从而导致患者易出现骨折的全身代谢性骨病[1-2]。患者最常见的临床表现为腰背疼痛或全身骨痛，通常在姿势改变时及长时间行走后出现，夜间或负重活动时疼痛加重，有可能出现行动受限，疼痛多为弥散性。其他临床表现为骨折、脊柱变形等，严重者可能压迫心肺，出现循环、呼吸系统的功能异常，且长时间会对患者造成巨大心理负担[3]。一些早期的OP患者没有症状或只有疼痛，往往会被人忽视，等到病情加重时常常已经发展到了较为严重的阶段，所以OP又被称为“寂静的疾病”。目前OP的发病机制以及治疗方法需要进一步研究，建立骨质疏松模型是进行发病机制及治疗药物研究的必要条件，根据研究需要，应尽可能选择与人类相似度高、重复性好、经济有效的模型。斑马鱼(zebrafish)作为现今常用模式生物，在骨骼疾病研究中，以独特的结构与生理提供了灵活高效的动物模型。本文拟对OP研究现状及斑马鱼骨质疏松模型建立方法和研究应用进行综述，为相关实验研究提供参考。

1 骨质疏松症的研究现状

骨质疏松症可分为原发性、继发性和特发性三大类[4]。不同类型的骨质疏松有不同的病因，是多种因素共同作用的结果[5]。 OP的具体分类和病因学研究见表1。骨骼发育涉及多种关键的生物学途径或信号转导通路，全基因组关联研究报道了60多个影响BMD的位点,证实了BMD基因的多态性。由表1可看出OP涉及到其中多种关键的生物学途径[11]，如Wnt信号通路、维生素D内分泌途径、雌激素内分泌途径、核因子κB受体活化因子-核因子κB受体活化因子配体-骨保护素(RANK-RNAKL-OPG)途径等。

表1 骨质疏松症按病因分类及病因学研究进展

2 斑马鱼骨质疏松模型的建立

斑马鱼的骨骼由软骨和硬骨两种不同的组织组成,与其他脊椎动物骨骼发育过程极其相似。软骨由软骨细胞形成,硬骨由成骨细胞(osteoblast，OB)和破骨细胞(osteoclast，OC)组成，间充质细胞(mesenchymal cells，MSCs)是软骨细胞和OB的共同起源，OC则起源于髓单核细胞系。斑马鱼的OB和OC都与哺乳动物具有相似的功能。和高等脊椎动物一样，斑马鱼既有膜内成骨，即颅骨的形成是由OB直接形成骨骼；也有软骨内骨化，是由OB和OC通过逐步替换软骨模板的方式，从头到尾的顺序分体节在配卵后的2～3 d开始发育形成斑马鱼的脊椎骨骼[12-13]。

斑马鱼体型小，成熟周期短，繁殖效率高，其行为学特性易于观察,可动态观察生命健康状态和病理变化表观特征。斑马鱼基因与人类基因相似率可达到 87%。斑马鱼模型在基因转录与敲除等方面可塑性也比较强[14-15]。传统上，斑马鱼突变系是通过正向遗传筛选产生的，使用诱变剂[例如乙基亚硝基脲(ENU)]在后代中诱导随机点突变，然后筛选出感兴趣的表型[16-17]。现有的斑马鱼骨质疏松模型的建立方法都是将斑马鱼培养在适宜浓度造模药物的生活环境中，处理一段周期后，使斑马鱼的骨密度发生改变。诱导斑马鱼建立骨质疏松症模型的药物见表2。现有的斑马鱼骨质疏松症造模方法，使得斑马鱼骨质疏松模型的应用存在限制。

表2 斑马鱼骨质疏松模型的建立方法

目前研究斑马鱼骨骼模型的最常用方法是通过经典骨骼染色并在荧光显微镜下进行观察。常用的化学染料有茜素红(alizarin red)和钙黄绿素(calcein)等。茜素红染色为固定染色，通过与骨中的钙结节引起的显色现象来检测鱼的骨形态和BMD，毒性强具有特异性，用于斑马鱼硬骨染色,但实验前期步骤较多,耗时较长。钙黄绿素染色为活体染色，与骨骼中的钙化离子结合，在荧光的照射下发出绿色荧光来显示骨骼钙化程度，荧光信号强、毒性弱、染色时间短,但无特异性，可以实时观测胚胎骨所有时期的发育，需要注意染色过程要避光且要将染色液清洗干净,防止对荧光信号产生影响[22]。活体荧光染色主要研究斑马鱼幼鱼的骨骼钙化及成鱼尾鳍的再生等,而影像学技术也被用于斑马鱼骨骼的观察，如X线检测、显微CT等，能够更精准的评价骨的质量,更适用骨质疏松症的早期检测[23]。

3 斑马鱼骨质疏松模型的应用

3.1 斑马鱼骨质疏松模型在药物活性筛选中的应用

在斑马鱼骨质疏松模型建立中常选野生型品系的斑马鱼，采用泼尼松龙或地塞米松造模，因其可以显著抑制斑马鱼早期的骨骼发育形成[24]。徐宇等[25]分别用25、50、100 μg/mL 浓度的醋酸泼尼松龙造模,通过死亡率及脊椎荧光染色的个数来确定泼尼松龙对斑马鱼的最佳造模浓度为25 μg/mL。斑马鱼模型能快速、动态地观察骨的早期发育，为大规模筛选抗骨质疏松药物提供可能。斑马鱼骨质疏松模型抗骨质疏松药物活性成分的筛选见表3。

表3 斑马鱼骨质疏松模型抗骨质疏松药物活性成分的筛选

3.2 斑马鱼骨质疏松模型在药物安全性中的应用

斑马鱼骨质疏松模型不仅可以快速筛选抗骨质疏松药物，也可同时检测药物毒性。凌洁等[30]用高效液相色谱分析捕获补骨脂成分/组分联合泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型快速筛选抗骨质疏松活性成分，并同时考察死亡率，确定补骨脂酚毒性较大，高剂量会达到100%死亡率。王茉等[31]提出形成斑马鱼代谢-效应/毒性(M-Act /Tox) 一体化评价的新方法。葛静等[32]基于斑马鱼代效毒一体化有效的评价箭叶淫羊藿的代谢、抗骨质疏松效应及毒性。实现化合物用量少(微克至毫克级)、微板中快速进行的兼顾体内外有效成分和安全性的高效系统筛选，为抗骨质疏松药物筛选提供新的思路方法。

3.3 斑马鱼骨质疏松模型在研究作用机制中的应用

在斑马鱼骨质疏松模型研究药物抗骨质疏松活性时，也可以联合电感耦合等离子发射光谱串联质谱(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)、实时荧光定量核酸扩增检测系统(quantitative real-time，qPCR)和分子对接技术等同时研究药物作用机理，为药物在人体的作用机制做出铺垫。斑马鱼骨质疏松模型在研究药物等作用机制中的应用见表4。

表4 斑马鱼骨质疏松模型在药物药效机制研究方面的应用

4 总结和展望

体外细胞药物筛选模型可高通量、多指标、多靶点同时检测,但是忽略了药物在体内ADME等生理过程,因此筛选出的一些有效成分具有活性低、毒性高、生物利用度低等缺点。目前用于高通量药物筛选的果蝇和线虫模型可以满足高通量、多靶点筛选,但不能反映脊椎动物的体内药效过程。斑马鱼具有与人体相关性高、可以活体实验、样品用量少、筛选快、准确率高等优势,在药物活性成分或天然产物化合物的筛选等方面都有显著优势。但斑马鱼骨质疏松模型仍存在一定局限性：斑马鱼不是哺乳动物，体内脏器病理变化与哺乳动物有区别；斑马鱼躯体小，除骨染色观察、其他检测方法难以进行等。总体而言，对于骨质疏松症及相关疾病的研究，斑马鱼模型仍然是最佳选择，具有广阔的研究市场。