基于网络药理学的“淫羊藿-熟地黄”配伍治疗骨质疏松症作用机制研究

冯宜蒀 来积芳 董万涛* 海云翔 王凯 张小云 滕彦桥

1.甘肃中医药大学附属医院关节外科，甘肃 兰州 730000

2.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减低，骨组织微结构损坏，骨的脆性增加而易发生骨折为特点的常见全身性骨骼疾病[1]，中医学属“骨痿”“骨枯”范畴，多数医家认为“肾虚精亏”是OP发生的主要病机。肾主骨生髓，肾虚则精血无以化生，精亏髓乏则骨骼脆性增加，痿弱难用，故而引发OP。因此，从肾论治是中医治疗OP的基本大法[2]。

淫羊藿、熟地黄始载于《神农本草经》。淫羊藿味辛、甘，性温，归肝、肾二经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效[3]。熟地黄味甘、性温，功长于补，具有益精填髓、补血养阴之效[4]。两药相须为用是补肾阳、滋肾阴、填精髓的常用药对，可见于经典名方赞育丹及仙灵骨葆胶囊、骨疏康颗粒等中成药中。研究发现，熟地、淫羊藿配伍可显著提高糖尿病大鼠下肢骨密度，增加骨中钙、磷含量[5]。“淫羊藿-熟地”药对成分复杂，其对OP发挥的治疗作用涉及机体调控的多个生物过程和信号通路。本研究基于网络药理学方法，通过建立“药对活性成分-靶点-疾病”的可视化网络，从多成分、多靶点角度阐释“淫羊藿-熟地”治疗OP的分子机制。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库

BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)收集“淫羊藿-熟地”药对化学成分；GeneCards(https:// www.Genecards.org/)、OMIM(htt ps://www.omim.org/)数据库收集OP相关基因，Venny 2.1.0(https://bioinfo gp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线工具绘制韦恩图，找出相关映射；STRING 11.0数据库(https://string-db.org/)进行蛋白质相互作用分析；clusterPr ofiler R包对所获得的共有靶点进行基因本体论(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析；Cytoscape3.7.2(https://cytoscape.org/)软件构建网络及数据分析。

1.2 “淫羊藿-熟地黄”药对主要活性成分筛选及靶点预测

BATMAN-TCM数据库具有中药小分子研究相关靶蛋白及相关功能的特点，是一种采用逻辑回归、“弃一法交叉验证”构建的靶点预测工具[6]。通过BATMAN-TCM数据库搜集“淫羊藿-熟地黄”所有化学成分，以Score cutoff≥20，P≤0.05作为筛选阈值并结合文献报道确定最终药物活性成分。后对有效活性成分所对应的潜在靶蛋白进行逐一搜集，得到药物对应的潜在靶点。

1.3 OP疾病相关靶点获取

GeneCards与OMIM数据库是信息较为全面的疾病靶点、基因组数据库。GeneCards数据库可提供基因、基因与疾病关系等多种信息，OMIM数据库含有已知的孟德尔疾病、15 000条基因信息和人类关注的表型和基因型之间的关系[7]。以“osteoporosis”为检索词在GeneCards数据库及OMIM数据库中检索得到OP疾病相关基因，对搜集到的疾病靶点处理、去重后，得到OP相关靶点。

1.4 “淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的潜在靶点

利用Venny2.1.0在线工具将“药物-靶点”与“疾病-靶点”进行映射，绘制Venny图并得到“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的作用靶点。

1.5 靶点蛋白与蛋白相互作用(PPI)网络分析

STRING数据库构建的蛋白质相互作用网络具有显示蛋白质分子间直接物理相互作用和间接功能相关性的特点[8]。将1.4中获取的药物治疗疾病潜在靶点上传至在线STRING 11.0 数据库，获取蛋白互作信息，并使用R软件绘制互作网络邻接节点数目图进行拓扑分析。

1.6 生物功能与通路富集分析

使用clusterProfiler R包对获取的“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的关键靶点(pvalueCutoff<0.05，qvalueCutoff<0.05)进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，探讨“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的相关生物过程及信号通路。

2 结果

2.1 “淫羊藿-熟地黄”药对主要活性成分及靶点

通过BATMAN-TCM数据库输入复方中药进行化合物及靶点预测(Score cutoff≥20，P≤0.05)，共获得“淫羊藿-熟地黄”药对中地黄苷A(Rehmannioside)、尿嘧啶核苷(Uridine)、山柰酚(Kaempferol)、木兰花碱(Magnoflorine)等13个主要化学成分和134个蛋白靶点。

2.2 “淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的潜在靶点

使用Venny2.1.0在线工具将获取的134个复方(YYHSD)靶点和3 231个OP(经OMIM和GeneCards数据库共同筛选所得)靶点映射后得到共同靶基因57个，结果见图1。

图1 成分靶点-疾病靶点维恩图

2.3 蛋白互作网络

利用String软件对上述57个交集靶点构建蛋白相互作用网络。使用R软件绘制互作网络邻接节点数目图，邻接节点数目越多表示该基因处在蛋白互作网络核心位置，对整个网络起关键作用(图2)。由图3柱状图可以看出，前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、雄激素受体(AR)、雌激素受体1(ESR1)、细胞色素P450c17a(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)等可能是“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的核心靶点。

图2 互作网络邻接节点数目

图3 蛋白相互作用网络图

2.4 “淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的GO富集分析

使用clusterProfiler R包对2.2中所获取的57个“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的潜在靶点进行GO功能富集分析。从生物过程(biological process，BP)、细胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3个层面对关键靶点进行不同生物学过程分析，依据P<0.05列出排名靠前的GO富集分析结果，包含单胺类运输(monoamine transport)、血液循环(blood circulation)、G蛋白偶联受体信号途径(G protein-coupled receptor signaling pathway)等生物过程；轴突部分(axon part)、神经元细胞体(neuronal cell body)、轴突终末(axon terminus)等细胞成分；黄素腺嘌呤二核苷酸结合(flavin adenine dinucleotide binding)、G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)等分子功能。见图4、5。

图4 GO富集结果柱状图

图5 GO富集结果气泡图

2.5 “淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的KEGG通路分析

使用clusterProfiler R包对2.2中所获取的57个靶点进行KEGG通路富集分析，确定了11条主要信号通路，包括神经活性配体-受体相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、类固醇激素的合成(steroid hormone biosynthesis)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)等，涉及代谢、炎症、免疫、激素合成等多个方面，见表1、图6。

表1 KEGG通路分析

图6 KEGG富集结果柱状图

2.6 构建“药物-活性成分-OP-作用靶点”网络

将OP和“淫羊藿-熟地黄”复方(YYHSD)获得的57个靶点，整理出“药物-活性成分-OP-作用靶点”交集网络，获得135对关系对数据，72个节点。使用Cytoscape 3.7.2软件进行图形可视化(图7)。红色六边形代表骨质疏松症，蓝色四边形代表中药，黄色三角形代表化合物，绿色圆形代表靶点。

图7 YYHSD-骨质疏松症-化合物-靶点网络图

3 讨论

单味中药及复方治疗原发性骨质疏松症具有整体调节、副作用小、疗效确切等优势[9]，通过作用于不同的器官或组织，可在多层面、多途径、多靶点上发挥补肾益精强骨之功。本研究基于网络药理学方法，从药物、疾病两方面分析了“淫羊藿-熟地黄”药对有效成分，筛选出“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的潜在靶点，并对其中的关键靶点进行了功能富集和信号通路富集分析。

结果表明，地黄苷A、梓醇、山柰酚等是“淫羊藿-熟地黄”药对中抗OP的主要成分。熟地黄主要活性成分环烯醚萜苷主含地黄苷A及梓醇等成分[10]，地黄苷A能够增加骨髓有核细胞数和DNA含量，促进粒细胞增殖，亦可通过刺激B淋巴细胞和T淋巴细胞增强体液免疫和细胞免疫功能[11-12]。由此推断，地黄苷A对OP发挥治疗作用可能与其促进骨髓细胞增殖及增强免疫有关。OP引起骨髓微环境病理改变，影响骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖与迁移，促进其凋亡，这使得OP时正常MSCs难以分化为成骨细胞来修复受损骨组织[13]。骨系统和免疫系统间存在密切联系，OP的发生使T细胞被激活，活化的T细胞分泌 TNF-α、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)，进一步刺激核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达，从而激活破骨细胞的活性，导致骨质疏松加重[14]。梓醇可通过促进成骨细胞的增殖、分化及骨形成调节骨代谢[15-16]，亦可上调BMP2、RUNX2和Osteriex等调节成骨细胞形成、分化关键因子的表达，增加MC3T3-E1成骨细胞的增殖，提高成骨细胞碱性磷酸酶活性(ALP)及增加骨桥蛋白，从而促进成骨细胞的分化[17]。山奈酚可显著增加早期和晚期成骨参数，包括碱性磷酸酶(ALP)活性、胶原合成、Runx2、osterix、骨桥蛋白和骨唾液蛋白mRNA表达水平。通过刺激雌激素信号传导，进而激活WNT信号传导途径，实现其潜在的护骨作用[18]。

通过PPI网络构建及扑分析后发现PTGS2、AR、ESR1、CYP19A1等可能是药物发挥治疗作用的核心靶点。前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)又称环氧合酶(COX)，COX-1和COX-2是其两个亚型。研究证实，在诱导骨细胞信号转导方面，COX-2表达诱导产生前列腺素E2(PGE2)可降低颅骨细胞培养基中成骨细胞的分化，通过破坏COX-2的基因可促进大鼠颅骨细胞中成骨细胞的增殖[19]。另有研究表明，去势大鼠的骨组织中COX-2表达增强，通过抑制COX-2的表达，可减低破骨细胞的分化[20-21]。雄激素调节骨代谢依赖AR介导，AR在MSCs、成骨、破骨细胞及骨细胞中均有明显表达，其主要通过促进MSCs向成骨细胞分化，促进成骨细胞骨化、矿化以及抑制破骨细胞分化等方式进行，调控机制与Wnt/β-catenin、MAPK、BMP/SmadsRunx2等通路有关[22]。ESR是一类配体活化的转录因子，包括ESR1和ESR2。ESR1与中国绝经后妇女的骨折发生风险存在相关性[23]，ESR1调节骨代谢可能通过转化生长因子β(TGF-β)途径和抑制IL-6的活动来发挥雌激素激动剂样作用[24-25]。芳香化酶抑制剂(AIs)可通过抑制外周组织CYP19A1活性以降低循环血中的雌激素水平，导致人体骨密度减低，骨量丢失严重[26]。这提示CYP19A1可能是“淫羊藿-熟地黄”药对发挥作用的主要靶点，为“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的分子作用基础给出了新的预测，为进一步验证提供了新的线索。

在GO通路富集和KEGG通路富集分析结果中，“淫羊藿-熟地黄”药对能够调节血液循环、细胞钙离子稳态、G蛋白偶联胺受体活性等生物功能，亦可调控cAMP信号通路、类固醇激素的合成、神经活性配体-受体相互作用等。血液循环在OP的发生、发展变化过程中起着重要作用。Qiu等[27]探讨血液循环与骨密度丢失关系的研究中发现，血红蛋白与OP的发生有关，其水平的高低与骨密度呈正相关，提示可能与促红细胞生成素(EPO)在骨重建中的作用、组织缺氧、酸性物质堆积等因素相关[28-29]。细胞内游离的Ca2+([Ca2+]i)具有第一信使的作用，可参与调控成骨细胞的骨形成，并在维持骨代谢动态平衡方面发挥着重要作用[30-31]。cAMP是细胞内重要的第二信使，淫羊藿苷通过激活cAMP/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)途径促进成骨细胞的成骨，通过提高细胞内cAMP水平和促进PKA和CREB磷酸化激活成骨细胞的cAMP/PKA/CREB信号转导。用cAMP合成腺苷酸环化酶(AC)抑制剂和PKA抑制剂阻断cAMP/PKA/CREB信号传导，可明显抑制淫羊藿苷对成骨细胞的成骨作用[32]。目前尚无神经活性配体-受体相互作用和OP的相关报道，但神经-内分泌-免疫(NEI)网络学说认为，神经系统、内分泌系统及免疫系统共同调控机体内环境的稳态，这主要依靠各种神经递质、细胞因子、激素等作为介质发挥协同作用。NEI网络可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)实现对OP的免疫调节作用[33-34]。

综上，利用网络药理学可预测“淫羊藿-熟地黄”药对治疗OP的潜在靶点、生物学过程及信号通路，揭示其治疗OP的作用机制，对今后开展相关生物学实验验证提供了参考和依据。但网络药理学研究疾病靶点数据库主要通过现代医学疾病名称进行检索，本研究对骨质疏松症具体证型未进行细化探讨。后期的研究中需对疾病及其分型进行深入探索，以辨证为纲，进一步理解病与证间的内在联系，对基础实验和中医临床证候进行有效整合，构建病证结合网络模型，为病证结合研究提供新的思路与方法。