废用性骨质疏松动物模型的研究进展

杨琛 李兴勇 张超 杨浩 黄琛 左鹏刚

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030

2. 甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730030

废用性骨质疏松症(disuse osteoporosis, DOP)是由于骨骼机械负荷力的减少而引起局部或全身骨量丢失的疾病。DOP可发生于脊髓损伤不能运动的患者以及其他由于疾病或手术而长期卧床休息的患者，此外，宇航员长期处于太空失重环境下，其骨组织(尤其是下肢)由于缺乏正常的机械负荷刺激也会发生废用性骨质疏松[1]。DOP发生骨折的危险程度是正常人的4倍，为家庭和社会带来了沉重的经济负担[2]。了解DOP的病因及发病机理，对于预防和治疗DOP具有重要的临床意义。当前对DOP的病因病机学研究取得了一定进展，但其具体的发病机制目前仍尚未完全明确[3]。

动物模型在临床前研究中发挥着不可替代的作用，理想的动物模型对研究DOP的病因病机、发展过程、积极预防和药物治疗等具有重要意义。常用于构建废用性骨质疏松模型的动物有大鼠、小鼠、冬眠熊、火鸡、猪、猴子灵长类动物模型等。目前研究中常用的DOP动物模型有去势法动物模型、固定法动物模型和其他类型动物模型(图1)，现将以上造模方法进行总结，为该病的造模研究提供有价值的参考依据。

图1 常见的废用性骨质疏松动物模型的造模方法

1 去势法动物模型

1.1 脊髓切断模型

此种造模方法具体为，剪开大鼠的皮肤，剥离肌肉组织，在T10水平行椎板切除术，将脊髓完全横切，脊髓横断10 d后，开始出现DOP症状[4]。Jiang等[5]应用此法的结果显示，去脊髓大鼠ALPase活性、前胶原和骨钙素的产生以及骨钙素、Runx2和成骨相关转录因子抗体的基因表达以及成骨细胞活性明显低于后肢固定大鼠，即去脊髓大鼠成骨细胞对机械负荷的反应低于对照组。Otzel等[6]使用T9椎板切除术联合中重度脊髓挫伤造模法的结果表明，此模型显示松质骨迅速退化，皮质骨逐渐丧失，并出现全骨机械缺陷，类似于在运动完全性脊髓损伤人群中观察到的后遗症，提出低睾酮和(或)瘦素可能是脊髓损伤后骨退化的分子机制的设想。

1.2 坐骨神经切除模型

其造模方法为，通过手术法切除模型动物的单侧坐骨神经，造成一侧肢体的运动障碍而发生DOP。Brouwers等[7]将此模型与去卵巢大鼠模型的骨量丢失作比较，发现坐骨神经大鼠模型的骨小梁数量、分离情况及骨骺端的连接性明显比去卵巢大鼠模型差，即废用模型比去卵巢模型的骨结构和机械性能更差。Desouza等[8]通过延长这种模型动物的胫骨长度来验证恢复老龄小鼠的负荷反应，发现随着年龄的增长，长期延长胫骨会使机械适应能力下降，增强骨皮质强度而非骨小梁强度。此模型多用于药物研发[9-10]。

1.3 臂丛神经切除模型

该模型的造模方法为，将兔模型麻醉后切开暴露术野，分离全臂丛神经到神经根孔处切断并向远端游离2 cm切断后旷置，缝合，造成该侧肢体运动障碍而逐渐出现DOP[11]。该模型造模原理与坐骨神经切除模型原理相似，但既往文献中关于此种模型的报道较少。

2 固定法动物模型

2.1 尾部悬吊模型

尾部悬吊模型是目前使用最广泛的DOP造模方法，具体[12]为，使用70 %的乙醇清洗动物尾巴后涂上安息香酊剂，将外科手术胶带绑在尾巴的末端形成一个环，再用三条弹性胶带固定手术胶带，将环连接到头顶的横杆上，并且横杆的高度需要调节以使动物后腿被抬高到笼子的地板之上且头朝下倾斜30 °，人为的造成动物失重或者模拟失重状态，使骨质水平降低，钙磷代谢处于负平衡，最终导致骨质丢失。后肢悬吊废用可引起DNMT1的上调和启动因子H19的高甲基化，这导致了lncRNA-H19的下调和ERK信号的抑制[13]。Paiva等[14]的研究表明在正常大鼠和尾部悬吊致DOP大鼠的骨愈合中，骨量减少不影响骨愈合过程，无论骨折是否骨质减少，时间都是一个独立的决定因素。也有学者发现在最初废用期后和随后废用期后采用中等强度的阻力训练并不能改善DOP严重程度[15]。目前该模型在药物(特别是中医药)抗DOP的作用和作用机理方面应用广泛[16]。

2.2 腿尾固定模型

具体造模方法为，消毒后的0.1 mm医用钢丝穿过后肢一侧踝部松紧适宜地固定到距肛门1～2 cm尾根处，一般4周即可造成DOP动物模型[17]。唐学阳等[18]为研究DOP对维生素D受体表达的关系，使用此法将大鼠分别固定2周和4周，采用免疫组织化学和图象分析方法检测固定对DOP大鼠模型VDR表达的影响，结果发现幼鼠固定侧肢体骨VDR表达的增强与固定有关。成勇等[19]对此模型进行了改进，即在距大鼠肛门1 cm的尾根部缠绕医用胶带，以加大铁丝的受力面积，从而减轻钢丝对尾部的压迫。

2.3 石膏绷带固定模型

该模型适用于犬、家兔等体积中等的动物。造模方法为，使用石膏绷带将动物的一侧后肢包裹2～3层，石膏绷带每两周更新一次以防止石膏绷带松动或肢体发生压疮[20]。马信龙等[21]通过实验研究发现石膏绷带固定诱发DOP模型大鼠胫腓骨在不同时间点之间的最大负荷、弹性模量与钙含量都明显低于正常大鼠，且马森染色显示随着废弃时间推移，胶原蛋白逐渐减少，说明DOP是由肌肉不活动和负重减少引起。通过石膏绷带固定DOP模型，可以很好地理解骨、关节软骨、肌肉、神经和血管的变化。

3 其他类型动物模型

3.1 药物诱发模型

Chappard等[22]描述了一种使用肉毒杆菌毒素(botulinum toxin, BTX)麻痹大鼠后肢肌肉的模型，以研究废弃对骨骼的影响。BTX是一种神经毒性蛋白质，由肉毒杆菌产生。BTX充当蛋白酶，用于阻隔运动终板突触前部分的SNARE复合体的SNAP-25，从而抑制乙酰胆碱泡停靠突触前膜。因此，用BTX注射会使骨骼肌瘫痪，导致注射肢体的固定。但BTX导致的废用是非永久的，一般情况下注射BTX后4～5 d开始瘫痪，8～9 d承重能力部分恢复。BTX主要用于小鼠、大鼠和兔子，其具体造模方法为，根据研究的部位而选择相应部位肌肉注射BTX。Vegger等[23]分别对雌性的16周龄小鼠和44周龄小鼠的同一后肢注射BTX，通过观察同一部位骨强度和骨密度，结果表明幼鼠和老龄鼠的骨量丢失无显著差异。该模型为可逆转模型，且在评价药物治疗DOP的作用和设备研究方面应用广泛[24-25]。

3.2 基因工程诱导模型

该造模原理是模拟人体因某种基因突变或表达异常而发生DOP，主要通过对某些基因的失活、突变或增强表达，以此来研究这种基因在DOP发病过程中的作用机理，这有助于DOP的诊断与治疗。Akhter等[26]为确定LRP5 G171 V突变是否能防止废弃相关的骨量丢失，测量了野生型、LRP5敲除型和带有LRP5 G171 V突变型小鼠的骨小梁厚度等指标，发现LRP5敲除型的骨小梁数量和厚度减少20 %，而LRP5 G171 V突变型减少6 %～11 %。目前证实的与DOP有关的基因包括Lrp5、LRP6、LncRNA-H19、Sost、(Cx)37、β连环蛋白、BCL2等[27-29]。

3.3 冬眠熊模型

冬眠熊模型是研究人DOP的极好模型，因为冬眠是肌肉骨骼废弃不用的自然模式，且熊和人类有相似的下肢骨骼形态，熊能像人类一样走路。冬眠熊在长时间废用(即冬眠)期间不会出现DOP[30]。Donahue等[31]将圈养冬眠熊放置在与其体积对应的铺好稻草的涵洞中，它们在冬眠期间是不活跃的，观察4～4.5个月，发现熊会每天进行3～4次颤抖(发抖)。熊的这种颤抖(发抖)可能足以通过一种涉及低强度、高频机械刺激的机制来维持小梁骨量和微结构，因此现在的研究中也有学者通过低强度、高频机械刺激来探索对DOP的作用[32]。由于熊的价格与饲养成本较高，目前国内还没有相关文献报道。

3.4 联合造模法诱发的DOP模型

DOP发病机制复杂，发病因素多样化，因此采用多因素联合造模或同一试验中使用两种以上的造模方法具有很大的意义与应用价值。联合造模法还具有造模周期较短，造模效果好等优势，因而在近年来应用较多。如CIZ基因缺陷型联合尾部悬吊法[33]、去卵巢联合尾部悬吊法等[34]。Niziolek等[35]在两种不同的Lrp5 高骨量基因敲入小鼠模型中，利用尾部悬吊法和药物BTX诱发法发现，Lrp5高骨量等位基因提供了显著的保护，防止废弃的再吸收效应和雌激素的戒断，因此，提供了一个潜在的机制来模拟药物干预，以防止各种骨浪费。

4 讨论

DOP动物模型为认识DOP的生理病理特点和验证药物的治疗效果提供了一种较为科学的手段和方法。理想的动物模型设计应符合相似性、方便性、关联性和适宜性的原则。目前各类模型动物各有特点，造模的方法也各有侧重，因此所制作的模型动物往往只能在某些方面如病因、临床症状或病理变化表现出DOP的特征。

去势法造模通过手术的方法切断脊髓或神经从而达到局部废用而产生DOP，固定法造模通过非手术方法固定局部肢体或使肢体失重达到废用效果而产生DOP，一般来说手术造模产生DOP的速度要快于非手术方法[36]。这两类造模多适用于药物的研发；尾部悬吊诱发的DOP动物模型为应用最广泛的造模方法之一，虽然此法常易使模型鼠尾部溃烂，但其对骨骼废用过程中抑制和恢复骨形成所需的时间较短且可预测，还可对同一动物的废用骨骼和正常骨骼进行直接比较，因此，该模型有助于研究体内骨形成的调节因素；药物BTX造模法操作简单且具有可逆性，可模拟急性废用产生的DOP。但应认识到BTX具有很强的不良反应，BTX中的肉毒杆菌毒素底物-1可以降解骨骼中的有机物和无机物且参与了破骨细胞的分化通路[37]，这可能会影响实验结果；基因工程造模法是近年来随着基因研究的深入而逐渐发展起来的一种新兴造模方法，可从基因层面探索DOP与基因的关系从而达到精准治疗，但由于基因工程造模操作难度系数和费用较高[38]，目前该领域的相关研究较少；冬眠熊与人类有相似的下肢骨骼系统，但长时间废用(冬眠)而不会产生DOP，因此研究冬眠熊的骨代谢机制可为治疗人类DOP提供有价值的见解。但由于我国地理位置原因，冬眠熊资源短缺，获取成本高，未曾发现有相关文献报道。

我们应该认识到动物与人类在骨质构造方面存在差异，因此只能间接的模拟人类疾病，而不能完全替代人类疾病，只有在动物模型与人类DOP发病机制和病例特点相似的情况下，DOP动物模型的实验才有借鉴意义。随着人们对DOP研究的深入，DOP建模方法及评价方法也在不断完善，人们认识到DOP可能是由多因素引起，因此采用联合造模方法反而更能模拟出与人类DOP发病机制相似的动物模型且更贴近于临床实际，未来还需进行更多的研究甚至进行动物循证学的研究来证明其优越性。