荧光激活细胞分选技术加速酶定向进化

朱润涛，高浩峰，杨一帆，刘永琪，李佳祺，张 霞，胡 南

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800)

酶是具有高催化效率、专一性的有机大分子，它在生物催化、高分子合成和医药开发等领域有着广泛应用[1]。成功的生物催化反应取决于具有优良特性的酶。虽然天然酶可以通过发掘基因组数据库、筛选宏基因组文库获得[2-3]，但是天然酶难以满足工业应用的需求。因此，在未来酶工业化应用中，需要对酶的催化特性进行改造以满足应用的需求[4]。

分子定向进化是设计工业酶的一种强大、快速且可靠的方法。2018年诺贝尔化学奖授予了定向进化先驱——美国科学家Frances H.Arnold女士，这一奖项肯定了蛋白质定向进化作为工业领域标准化的通用工具及自它诞生之后带来的广泛社会效益。定向进化通过改造天然酶，获得一系列具有强催化活性[5]、底物选择性[6]和立体选择性[7]等优良特性的突变体，这些优势可以应用于化学原料药与医药中间体的绿色合成等。更重要的是，定向进化推动了人类由化石能源时代向可循环生物经济时代迈进[8]。

定向进化技术是在基因水平上通过多轮突变，构建高通量突变文库，然后在蛋白质水平，利用高通量筛选技术，获得高活性突变体的一种技术(图1)。但是，建立高效、成熟的高通量筛选方法是酶定向进化的瓶颈之一。最简单的筛选方法是平板筛选法(包括凝胶平板筛选和微量平板筛选法)，还可通过色谱法、光谱法或质谱法筛选突变体表型。人工筛选速率为103个/天，自动化筛选速率可以增加到105个/天[9]。毛细管电泳法在理论上是最简单的方法，但筛选速率不超过106个/天[10]。这些方法通常耗时且费力，无法达到高通量筛选的要求[11]。

图1 酶定向进化的基本方法Fig.1 Principles of directed evolution

荧光激活细胞分选技术(FACS)将表型与荧光信号耦联实现高通量筛选,设备由3个独立的组件构成(图2)：先采用区室化技术将基因型(例如，携带突变体DNA的宿主)与光学可检测的酶(例如荧光产物)在空间上分离，再测定反应室的光学信号，最后分离和筛选突变体。

图2 高通量筛选表型与基因型相耦联的微反应体系Fig.2 High-through screening genotype-phenotype coupling micro-reactions

Dittrich等[12]首先发明现代流式细胞仪,它能够分析细胞以及人造小体(如液滴和微球)的散射和多色荧光信号，或测定油滴的大小和荧光强弱[13]。本文中，笔者从基因型与表型的耦联方式对荧光激活细胞分选技术进行分类，以筛选速率和耦联相关性为主要依据，分析多种分隔技术的优缺点。

1 细胞展示高通量筛选技术

细胞可用作酶的天然反应容器，将突变体基因型与表型耦联。在定向进化进程中，荧光激活细胞分选技术能实现突变体的筛选和分离。因此，以细胞作为可测区室，具有广泛的通用性和高效性，但是难点在于如何将基因型与表型和胞内外荧光信号相耦联。

最直接的解决方法是使用天然存在于细胞内的生物大分子，以周质空间作为生物反应器，将蛋白的特异与荧光蛋白荧光强度相耦联。Santoro等[14]已经成功地使得改造过的DNA重组酶能够识别新的loxP突变位点。Wang等[15]将底物与绿色荧光蛋白(GFP)耦联，使得蛋白伴侣增加了折叠腔极性的同时，改变了腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)酶循环。Peck等[16]发现，小分子物质4-羟基三苯氧胺(4-HT)能够加速GFP标记的内含肽剪切分裂，细胞内内含肽的剪切活性升高，最终使得内含肽的剪切效率提升了2～8倍。Hess等[17]将GFP标记的小向导RNA(sgRNA)与细胞内的靶标结合，进而通过FACS快速分离，结果扩大核酸内切酶(dCas9)的PAM识别序列。Mo等[18]利用分割型GFP(split-GFP)提升耐热脂酶的催化活性与可溶表达能力，而与完整型GFP相比，背景荧光强度与假阳性率更低，荧光强度与可溶性和酶的催化能力相关性更强。

如果荧光底物难以穿透细胞，无法使得酶活性与胞内荧光相耦联达到检测筛选的目的，这时可以通过使用外部荧光底物来改造不能携带荧光信号的突变型。如,在利用大肠杆菌改造糖基转移酶时，荧光标记的糖底物通过转运蛋白进入细胞，随后，酶切割使荧光产物不能离开细胞，从而分离荧光细胞，同时也可以使荧光底物与突变体活性耦联，从而将荧光物质包裹在细胞表面从而完成筛选[19]。Schwaneberg研究团队的Ruff等[20]利用细胞色素P450单加氧酶能够将带有荧光特性的底物7-苯甲酰氧基-3-羧基苯丙胺乙酯分解为非荧光的7-羟基-3-羧基苯丙胺乙酯，从而筛选出活性的P450单加氧酶突变体，其活性比野生型提升了7倍。

在细胞表面展示技术中，为了维持基因型-表型连锁，可以将酶活性产生的荧光信号展示在细胞或小体表面。在细胞(或小体表面)上,底物与溶液中的荧光底物共存于反应液中，在胞内酶的作用下，酶的荧光底物与膜表面荧光底物结合，通过检测与酶活性呈正相关性的胞内双荧光信号，进而筛选出不同活性的突变体。例如，Lipovšek等[21]利用酵母细胞展示技术将辣根过氧化物酶表达在酵母细胞表面，进而与荧光标记的底物结合，使得FACS能够快速分选携带有荧光标记的活性突变体。或者,将突变体表达在酵母表面，进而使棕色底物(水杨羟肟酸)与目标蛋白质结合，利用FACS快速分选突变体[22]。Chen等[23]利用酵母细胞表面展示技术，并结合酶介导的生物共轭作用，快速筛选得到活性提升了140倍的共轭双选酶A。

像蛋白酶这一类能够破坏特殊功能键的酶，也可以采用表面展示技术来筛选。比如，使底物与荧光共振能量转移(FRET)探针结合，使得在酶处理后探针活性丧失进而筛选出活性突变体；也可以改造功能键合成的相关酶。Dorr等[24]利用表达在宿主表面的金黄色葡萄球菌分选酶A(SerA)能够转移荧光底物于表达细胞表面的特性，通过9轮FACS筛选获得活性提升51 000倍的SerA突变体。Yi等[25]通过细胞内表达蛋白酶突变体，将含有特异性切割位点的多标签融合蛋白分段切割，随后转运至细胞表面，将识别不同标签的荧光抗体与表面展示融合蛋白的大肠杆菌孵育，利FACS对细胞进行分选，最终使得蛋白水解酶(TEV-P)对不同切割位点的活性分别提高了5 000和1 100倍。此方法通过将产物转运至细胞表面，从而解决了细胞外部展示的突变表型与细胞内部基因型难以耦联的难题。

虽然细胞展示技术有许多成功的案例，但是依然存在许多问题。全细胞表达的优势在于能够以最小的代价表达出活性蛋白突变体，同时异源表达的宿主选择也较为丰富，常见的有大肠杆菌和酵母等。但是用全细胞展示技术表达的蛋白质或者多肽的活性，与其游离态相比，仍然会造成目标物部分或全部活性的丧失[26-28]。因此，FACS可以用来改造在细胞展示技术中有活性的天然酶及突变体，但是依赖于宿主本身的表达特性。若蛋白无法有效进行大肠杆菌展示，可以选用酿酒酵母等系统进行展示和改造[29]。所以，改造不同的蛋白质需要选择合适的表达宿主。

2 液滴微流控高通量筛选技术

若以细胞为区室，则会严重限制改造酶的类型，为了克服限制，Agresti等[30]在荧光激活细胞技术基础上发展出以液滴微流控位为代表的胞外隔室技术，使突变体表型与DNA或细胞的基因型在空间上分离。微流体在通道的尺寸和流速控制下每秒产生数千个液滴(表1)，其体积为10-12～10-9L，每个液滴(包含单个突变体)构成独立微反应器。在介电电泳作用下，荧光液滴被微流体筛选系统分选到收集室或废弃室，其筛选效果达到109个/天。Duarte等[31]通过低温冷冻，将含有绿色荧光突变体的表达细胞包裹于单乳相(油包水)的液滴之内，经FACS分选出不同荧光强度的突变体。Griffiths等[32]使用“水/油/水”双乳液滴作为区室，使用FACS快速分选，最终使得磷酸三酯酶活性提高63倍。

表1 液滴微流控筛选的参数

体外区室化筛选的优势在于液滴与突变体表型相容，适用于改造难以利用细胞对基因型与表型相耦联的工程体。若在液滴内应用无细胞蛋白质合成系统，可用来表达对细胞有毒性的酶，也可通过裂解细胞或液滴实现细胞表达产物溢出。正是因为这种灵活性，通过液滴技术改造的酶几年来发展较快[33]。例如，Ma等[34]利用双通道微流体技术形成油包水单乳相，使用FACS分选携带酯酶编码基因的大肠杆菌，最终使得酯酶的对映体选择性提高700倍。Ma等[35]利用水-油-水的双乳相结构和液滴内的活性突变体能够将荧光分子和底物复合体水解出荧光分子的特性，将荧光物质束在液滴内部，而含有活性突变体的液滴被FACS分离。

体外隔室技术需对液滴内的酶进行多步预处理，或将反应液注射，或合并入新液滴。同样的液滴可在扩增仪中反复加热，或在培养细胞的芯片或不同微流体之间多次注射，也可将液滴分开、冻融、配对和破碎。使用多步液滴方法来解除耦联，从而达到互不相容的体外翻译和酶活性测定的目的。如，Gielen等[36]研究发现，在油包水的单乳液中，通过破碎液滴内部突变体，利用液滴微流控技术快速筛选苯丙氨酸脱氢酶，进而得到酶活性提升4.8倍的突变体。

实际上，液滴是兼具通用性和灵活性的微反应器，并可用于复杂酶的测定。虽然它可以集成复杂光学器件和电子器件达到测定复杂酶的目的，但是实际的应用成本较高。为了克服这种高成本之类的限制，Love等[37]开发了一种传统FACS与仪器兼容的双乳液,将该乳液用于改造磷酸三酯酶，经过多轮筛选，得到磷酸三酯酶活性提升63倍的突变体。

虽然双重乳液可以顺利进入液滴网格，但不如单乳液坚固，需要平衡相关参数(表面化学黏度、流速等)才能产生均匀分散的液滴。即便如此，在高通量筛选期间，液滴形态仍然有可能被力学作用力破坏[5]。Fischlechner等[38]开发了一种利用聚合物凝胶-壳珠复合物达到FACS高效筛选单乳液的方法，在该方法中，聚电解质壳包围隔室由琼脂糖核心构成，用于捕获琼脂糖核心活性生物大分子，筛选速率为108个/天，提升20倍酶活性。

3 微室高通量筛选技术

微室是基于微小空间对基因型-表型连锁的突变体进行人工定向进化的反应器。目前，微室反应器主要包括两大类：96(或386)深孔板和毛细孔板。

深孔板主要由上面开口和底部封闭的柱体构成，柱体材质为玻璃、石英或有机高聚物等。深孔板能够在蛋白质水平对突变体进行改造[39]、筛选[40]和单分子检测与分析[41]。基于96孔板的高通量筛选技术是使用较多、应用较为广泛的筛选技术，主要通过直接检测与酶活性相关的荧光产物或者荧光底物的变化达到测定突变体的生理生化特性的目的。Heinisch等[42]利用大肠杆菌表面展示技术将烯丙基脱醛酶表达在细胞表面，使突变体蛋白与孔板内部荧光底物结合，多次洗脱后，进而分选得到高活性突变体。Lee等[43]在改造脂肪酶的过程中，通过水解二氢氰酸荧光素释放荧光素来快速筛选具有生物活性的脂肪酶。

毛细孔板主要由玻璃材质构成，平板包含了数百万个微小、具有高长径比的微米级的毛细管，而这些毛细管仅能够容纳单细胞或者单个微粒。在基于微毛细管的高通量筛选法中，Chen等[44]通过测定去磷酸化的荧光产物的变化来表征碱性磷酸酶的活性和底物特异性，该方法能够将微毛细管内容物在空间上快速分离，并在单细胞水平操纵提取物，达到快速筛选的目的。

微室筛选方法的优势在于，通过微量底物消耗，能够高通量筛选大量突变体，并通过测定微室中荧光信号的变化准确地测定酶学性质。在选取活性突变体之前，毛细孔板法和深孔板法能够利用荧光显微镜高通量地多点记录、筛选、测定和分析荧光变化。两种方法需要确保在微室中所包含的颗粒或者单细胞不超过1个，而其中浓度的计算需要依靠泊松分布[44-45]。随着新技术的发展，Chen等[44]将微室技术用来分析突变体酶活性，高通量筛选突变体库。因此，微室法在未来应用的主要障碍在于如何精确地向孔板内部添加试剂和单菌落，利用自动化的方法避免人工操作的错误[46]。同样,也利用无菌空气[47]、光钳[48]或光镊清空孔中的反应液。

4 筛选技术比较

虽然传统的微孔板筛选策略仍然是酶工程领域应用的主力，但已经出现了在更高通量下进行定向酶进化的新方法，并且已经证明了它们的高效性。高通量筛选技术进步，可以使我们通过更快的速度、更少的工作量和更有效的工作流程，加速酶的定向改造。因此，这些技术可以在更短的时间内更深入地探索酶的结构与功能的关系。因此，评估高通量筛选技术优劣时，必须考虑每种方法的优点和局限性(表2)。细胞区室技术的主要优点是使用细胞的天然组分去实现突变体的筛选，而用流式细胞仪筛选加速了筛选过程，可以容易地筛选和分离107级的文库。然而，胞内筛选依赖于底物进入细胞内部的方式，同时，细胞展示技术依靠酶在细胞(荧光底物或产物)上基因型与表型耦联的效果。相比之下，体外区室技术能够使酶的表达更加灵活，且可以精确控制反应物，从而实现最佳的筛选效果。但液滴的形成及其稳定性会受筛选体系中操作压力、表面张力和流速等因素影响较大，过强的外界压力致使液滴破碎，无法形成稳定的筛选小体。而细胞区室则会受到细胞本身条件的限制，如极端温度、压力和pH对细胞生长表达的限制。目前开发的玻璃或聚合物隔室会更加具有刚性和稳定性，但在筛选初期，微孔或微阵列难以控制孔径内部的反应物质滴加与清除，影响到高通量筛选中对反应现象的精确测定。因此，在实际应用中，应根据实际需要和每种筛选方法的优缺点选取最佳的高通量筛选体系。

表2 不同区室分隔技术的优劣

与此同时，荧光激活细胞筛选技术不仅仅局限于以上3种类型，也有基于颗粒的荧光激活细胞筛选技术，如Gotrik等[57]利用RNA适配体与非荧光染料结合后会产生强烈荧光信号的特性，首先将突变体RNA适配体和RNA固定化，然后与非荧光染料混育结合，最后FACS筛选出有较强亲和能力的RNA适配体的突变体。

5 结论与展望

高通量筛选技术是定向进化的瓶颈技术之一。目前，尚未出现一种能够应用于所有突变体基因型和表型的通用性筛选技术。因此，定向改造目标蛋白仍然需要针对不同酶、不同底物和不同反应类型进行设计。荧光激活细胞分选技术是近年来国内外发展较快的高通量筛选技术，其在药物筛选、代谢工程和酶工程等诸多领域应用广泛，因其能够筛选多种单体如细胞、液滴等天然或人工小体，使其具有高通量和高通用性的特性。在未来，荧光激活分选技术将会是最具发展潜力的超高通量筛选技术。