一种基于苝酰亚胺双离子型可视化荧光探针的合成及性质

张 曼,许晓娟,孙凌志

(1.南京工业大学 药学院,江苏 南京 211800;2.盐城师范学院 药学院,江苏 盐城 224007)

苝四羧酸二酰亚胺衍生物(PDIs)是一类重要的荧光材料[9],具有优异的光稳定性和热稳定性,发光效率高,光电性能优异。在光子材料、光电器件和分子开关等领域都得到了广泛的应用[10]。同时,因为它具有优异的接受电子和高荧光量子产率的能力[11]，因此被广泛用于传感器设计,PDIs是能检测各种化学物种(金属离子、有机分子和生物大分子)的荧光传感系统。由于其具有响应时间短、简单操作而备受关注[12-13]。

在过去几年中,越来越多被用于生理条件下重要的生物离子和分子荧光传感化合物被开发出来[14]。Georgiev等[15]合成了一种新型的水溶性苝四羧酸二酰亚胺作为荧光pH探针,但是其pKa值为6.35±0.02,只能在生理范围内进行pH测定,不能用于极酸性(pH<4)或极碱性(pH>10)环境下的双功能荧光探针。而笔者选择苝酰亚胺发色团作为新型探针中的荧光信号部分,在其酰亚胺位引入质子的识别基团吡啶,同时在其湾位引入苯氧基,降低电子跃迁能级,使该化合物的荧光发射范围接近近红外,以期使之有望成为裸眼可视化的pH探针。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苝-3,4,9,10-四羧酸二酐、2-(2氨基乙基)吡啶,纯度98%,上海阿拉丁试剂有限公司;苯酚、氯磺酸,纯度均为98%,其余试剂和溶剂均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。LDRX400 MHz核磁共振光谱仪,SolariX-70FT-MS型超高分辨质谱仪,美国Bruker公司;TripleTOF 5600+型高分辨质谱仪,加拿大AB SCIEX公司;UV-1800型紫外分光光度计,日本岛津公司;Cary 20 Eclipse型荧光光谱仪,美国Varian公司;SQP型电子天平,德国赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 合成

1.2.1 5,6,12,13-四氯代苝四酸酐(化合物1)的合成

将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(5.05 g,12.76 mmol),I2(0.91 g,3.45 mmol)加入三口烧瓶,量取35 mL(0.50 mol)的氯磺酸缓慢滴加至三口瓶中,65 ℃加热搅拌20 h。冷却至室温,将反应液缓慢倒入冰水中,大量橙红色固体析出,过滤固体,并水洗至中性,干燥后得橙红色粉末，即化合物16.41 g,产率95.2%。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)δ8.75 (s,4H)。该固体无须纯化可投入下一步反应。

1.2.2 5,6,12,13-四氯-2,9-双(2-(2-吡啶基)乙基)苝二酰亚胺(化合物2)的合成

将化合物11.02 g,1.90 mmol),2-(2-氨基乙基)吡啶(0.50 g,4.20 mmol)在10 mLN,N-二甲基乙酰胺(DMA)和10 mL 二恶烷混合溶剂中120 ℃回流8 h。之后将反应液冷却至室温,加水析出深红色固体,过滤固体并干燥,之后用硅胶柱层析法(二氯甲烷与甲醇体积比为20∶1)纯化产物,得鲜红色固体，即化合物21.08 g,产率77.9%。电喷雾质谱法ESI-MSm/z:得到C38H20Cl4N4O4质荷比理论值为736.023 9,实验值为369.904 5，推测为[M+2H]2+。氢核磁共振1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d)测得δ8.66 (s,4H),8.54 (d,J=4.8 Hz,2H),7.72-7.66 (m,2H),7.33 (d,J=7.7 Hz,2H),7.23-7.19 (m,2H),4.64 (t,J=7.4 Hz,4H),3.30 (t,J=7.3 Hz,4H)。

1.2.3 探针PDI-1的合成

公共艺术的主要特征是“公共性”。这种“公共性”主要体现在对空间的运用上和对空间所有者“受众”的关注上。空间作为公共艺术表现的特殊“场”，是公共艺术存在的“物质”基础，如何有效的研究空间、利用空间、充实空间、创造空间，是公共艺术实践的重要手段。而作为空间所有者的“受众”的审美需求与文化诉求，是公共艺术创作“精神”依托，如何更好地体现关注大众、服务于大众，是公共艺术实践的终极目标。

将化合物2(0.20 g,0.27 mmol)、苯酚(0.21 g,2.16 mmol)、无水K2CO3(0.30 g,2.16 mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP,20 mL)中,并在N2保护下90 ℃反应过夜,之后将反应液冷却至室温,加入至甲醇和质量分数5%柠檬酸水溶液(体积比为1∶1)的溶剂混合物中,以产生棕黑色沉淀。过滤固体并洗至中性,真空干燥,粗产物用硅胶柱层析法(二氯甲烷和甲醇的体积比为20∶1)纯化,得深棕红色固体0.15 g,产率58.4%。C62H40N4O8质荷比理论值为968.284 6,实验值为494.151 15,推测为[M+H2O+2H]2+。1H-NMR (400 MHz,Chloroform-d):δ8.50 (d,J=5.0 Hz,2H),8.18 (s,4H),7.57 (td,J=7.7,1.9 Hz,2H),7.29～7.23 (m,8H),7.20 (td,J=7.8,1.1 Hz,2H),7.15～7.10 (m,4H),7.08 (m,2H),6.98～6.89 (m,8H),4.51 (t,J=7.5 Hz,4H),3.15 (t,J=7.5 Hz,4H)。核磁共振(13C-NMR) (Chloroform-d,100 MHz)得到δ163.12,158.70,155.83,155.32,149.39,136.42,132.84,129.98,124.60,123.25,122.58,121.53,120.55,120.09,119.96,119.62,40.38,36.39，具体合成步骤见图1。

图1 合成路线Fig.1 Synthetic route

1.3 光谱测定

在DMA中制备探针PDI-1母液(2.0×10-4mol/L),并逐级稀释为终浓度为4.0 μmol/L的探针储备液。同时用HCl和NaOH配备pH为1.0、2.0、3.0、4.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0的溶液,并且通过改变两种溶液的体积比来实现pH的梯度。将4.0 μmol/L的探针储备液1.0 mL加入1.0 cm×1.0 cm×4.0 cm石英比色皿中，并用不同pH梯度的溶液稀释至2.0 mL,得到不同pH条件下的样品溶液(2.0 mol/L)。对于选择性和干扰性实验中所用到的阳离子(Cr3+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Li+、Ca2+、Al3+、Mn2+、K+、Mg2+、Co2+、Ba2+、Sn2+、Cd2+及Na+)和阴离子(Br-、Cl-、I-、F-、BH4-、ClO-、CH3O-、NO3-、NO2-、CH3COO-、S2O32-、HCO3-、CO32-、HPO42-、S2-及HSO3-)储备液均由相应的盐酸盐或钠盐用超纯水制备,浓度为1.0×10-2mol/L。将4.0 μmol/L的探针储备液1.0 mL、离子储备液2.0 μL加入石英比色皿中,用pH 2.0和13.0的溶液稀释至2.0 mL,用荧光分光光度计获得荧光发射光谱。紫外光谱中运用20 μmol/L的探针储备液1.0 mL,加入1.0 mL不同pH的溶液,用紫外分光光度计测定。

2 结果与讨论

2.1 合成结果

苝四酸酐在I2的催化下与氯磺酸发生氯化,定量生成化合物1,无须纯化可直接进行下一步反应[16]。端位酸酐与氨基加热缩合引入乙基吡啶,得到化合物2[17]。碱性条件下,与苯酚发生亲核取代湾位的四氯反应得到PDI-1[18]。

2.2 PDI-1紫外可见吸收光谱

将PDI-1溶于DMA/H2O(体积比为1∶1)的混合溶剂中(浓度为20 μmol/L),分别测试酸性环境,中性环境和碱性环境的紫外吸收光谱,结果见图2。由图2可知:PDI-1类型分子紫外吸收一般有3个吸收峰,分别在435、520和560 nm(中性环境)。

图2 PDI-1(20 μmol/L)在不同pH溶液中的紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-visible absorption spectrum of PDI-1 (20 μmol/L) in different pH solutions

PDI-1在酸性和在碱性环境中,吸收峰呈现出不同程度的移动。以A0-0为例,随着酸性的增加,探针的紫外吸收从560 nm(中性纯溶剂)红移至570 nm(pH为1.0);另一方面,随着pH的上升,探针该处的吸收逐步蓝移至466 nm(pH为14.0),紫外吸收前后发生了94 nm的变化。端位吡啶上的氮原子由于孤对电子的存在,对酸性环境下的质子敏感,当氮原子质子化后,与酰亚胺的酰基氧原子产生氢键作用,具有吸电子作用,端位链接的4个苯氧基通过n-π共轭改变了苝母核的电子云密度,表现为紫外吸收红移。同时,随着溶液中氢离子浓度的变化,探针分子与氢离子结合的分子形态也在变化,导致探针聚集状态发生改变,所以也引起溶液的摩尔吸光系数的变化,导致pH 2.0和3.0时的吸收峰下降。而在碱性环境下,有可能是由于OH-与端位酰亚胺结合或其他反应,影响原有的共轭体系,造成了苝母核的紫外吸收蓝移。

2.3 PDI-1的荧光发射光谱

基于探针分子设计,可预测分子对H+的响应。在激发波长490 nm,狭缝 5 nm下,对PDI-1(2.0 μmol/L,DMA与H2O体积比为1∶1)的溶液中进行H+离子荧光滴定,结果见图3。如图3(a)所示：随着H+浓度的增加,在605 nm处荧光强度逐渐增强,溶液颜色从淡紫色变为粉红色,紫外下呈现红色荧光,荧光强度的最大相差倍数超过10倍。在pH 2.2～3.2范围内呈现良好的线性关系,线性方程为Y=2 118.1-634.49x,R2=0.993 9。根据Henderson-Hasselbach type方程[19]计算出探针PDI-1的pKa值为2.726。实验结果表明:探针PDI-1可用荧光法对pH 2.2～3.2溶液中的H+定量检测。

在加入NaOH溶液调节探针pH时,605 nm处的发射峰并没有如预想地回到初始水平形成分子开关,而是发射峰蓝移,在515 nm处形成了新的发射峰,并且随碱性溶液的增多,发射峰强度也在增强,因此猜想该探针可能对OH-敏感。在激发波长440 nm,狭缝 3 nm下,对PDI-1(2 μmol/L,DMA和H2O的体积比为1∶1)的溶液中进行OH-离子荧光滴定，如图3(c)所示。由图3(c)可知：随着OH-浓度的增加,515 nm处发射峰荧光强度逐渐增强,并且溶液颜色从淡紫色变为黄色,紫外下发出强烈的黄色荧光,荧光强度的最大相差倍数超过30倍。在pH 11.4～13.2范围内呈现良好的线性关系,线性方程为Y=55.941x-115.91,R2=0.992 5,根据上述公式计算改探针的pKb值为12.29。因此,探针PDI-1可作为H+和OH-离子的可视化定量型复合荧光探针。

图3 PDI-1在不同pH溶液中的荧光发射光谱Fig.3 Fluorescence emission spectra of PDI-1 in different pH solutions

2.4 稳定性实验

为了进一步检验探针PDI-1对H+和OH-识别的稳定性,分别进行了PDI-1识别H+及OH-离子的时间依赖性实验。结果发现:探针在中性条件下的荧光光谱基本保持不变,表明PDI-1在实验条件下具有良好的稳定性。PDI-1在酸性环境中时,其在605 nm荧光强度迅速增强,并保持稳定。PDI-1在碱性环境中时,其在515 nm处的荧光强度迅速升高,并不断增强,在50 min内趋于稳定并维持此发射强度，结果见图4。

图4 PDI-1对H+和OH-识别的稳定性实验Fig.4 Stability experiments of PDI-1 for recognition of hydrogen and hydroxide ions

2.5 选择性实验

为了评价PDI-1在复杂条件下作为pH复合探针的可行性,对PDI探针的专一性和抗干扰能力进行测试,结果见图5。如图5(a)所示：在探针溶液中,加入浓度为500倍(相对于探针浓度)的各种金属阳离子的去离子水溶液后,只有在pH 2.0时，探针在605 nm处有荧光增强效果,表明探针对 H+有优异的选择性响应。得pH 2.0的2 μmol/L探针溶液中加入不同金属阳离子(1 mmol/L)后,发现除Zn2+和Sn2+能够引起微小的荧光增强以外，其他金属阳离子几乎不影响探针的荧光强度,表明该探针对 H+识别几乎不受其他阳离子的干扰,表现出强抗干扰能力,可用于复杂环境的检测。对于OH-的识别和抗干扰能力的检测与H+相同,结果见图5(c)。由图5(c)可知:探针只有在pH 13.0时，在515 nm处有荧光增强效果,并且不受其他阴离子的影响,表明该探针也能够专一性识别OH-并表现出强干扰能力。选择性实验结果表明：PDI-1能够在复杂环境中专一性识别H+和OH-,为复合强酸强碱pH探针的开发奠定了实验基础。

图5 PDI-1选择性和抗干扰性实验Fig.5 Effect of other cations or anions on PDI-1 recognition H+and OH-

2.6 识别机制

常见的苝酰亚胺的荧光发光机制是通过阻断光诱导电子转移(PET)机制[20]。端位基团对苝母核荧光团产生PET作用,探针荧光被淬灭,与阳离子(包括H+)结合后,PET过程被禁阻,荧光探针发射荧光，结果见图6。最初推测是PET机制,即探针PDI-1端位上的吡啶中氮原子的孤对电子对H+的专属识别,阻断PET过程而发射荧光。但是存在问题:若PET机制是正确的,那么当PET过程被禁阻时,苝母核的紫外前后吸收变化不大,而在识别H+时,探针PDI-1紫外吸收变化明显。因此,认为探针PDI-1不只是PET型荧光探针,也同时存在分子内电荷转移(ICT)机制。

图6 苝酰亚胺PET型荧光发光机制Fig.6 The mechanism of PET fluorescence of perylene imide

推测由于端位吡啶的存在,探针PDI-1对溶液中的质子具有较强的结合能力,结合后形成的质子化吡啶,吸电子能力增强,与酰亚胺的酰基形成分子内氢键,吸引湾位苯氧基取代基的电子,导致苝母核的电子云密度改变,基态与激发态能级差改变,紫外吸收峰发生位移,ICT增强,荧光发射波长红移(图7)。当溶液pH进一步降低时,化合物的质子化形态的浓度较大,溶液中会存在较多的质子,与分子间氢键竞争吸引湾位苯氧基取代基的电子,竞争性抑制了苝母核的电子云密度,导致红移反而减少。

图7 PDI-1对H+的识别机制Fig.7 The recognition mechanism of PDI-1 to H+

图8 化合物3的荧光机制Fig.8 Fluorescence mechanism of compound 3

在探索PDI-1对溶液中的OH-的识别机制的同时,对模型化合物3-苝酰亚胺(化合物3)在碱性条件下发射荧光的机制做对照研究,结果见图8。从图8看出:化合物3是无湾位取代无端位取代的苝酰亚胺,在DMA/H2O(体积比为1∶ 1)的溶液中,几乎不发荧光,加入碱性溶液后,发出很强的黄色荧光。由此推断,OH-会夺走酰亚胺上的质子,形成酰亚胺负离子(化合物4和其共振结构化合物5),苝母核给电子能力减弱,原来的ICT也减弱而发出荧光。

从探针PDI-1的结构看出,PDI-1无酰亚胺质子,在碱性条件下不会发生类似的去质子化反应,而是OH-与酰亚胺结合可能得到化合物6或类似物,或反应生成含羧基和酰胺的物质(如化合物7),结果见图9。由图9可知:化合物6和7部分禁阻或完全禁阻ICT过程,导致苝母核基态和激发态能级变大,紫外吸收蓝移,最大发射波长(515 nm)蓝移[21-23]。

图9 化合物6和化合物7Fig.9 Compounds 6 and 7

3 结论

本文成功地合成出吡啶乙基端位修饰的苯氧基，同时在基湾位修饰的苝酰亚胺探针分子PDI-1，通过对其光谱性质研究，发现化合物在不同pH下的吸收峰呈现不同程度的位移，并且能分别在极酸条件和极碱条件下高效识别H+和OH-，在实验条件下具有良好的稳定性和专一性，且对识别机制做出了初步探讨。因此，该化合物有望成为复合强酸强碱的pH探针，笔者将对其机制和有关应用还在进一步研究中。