罗布麻叶配方颗粒与传统汤剂HPLC指纹图谱的相关性

黄杨敏,沈治平,朱阿金,李 超

(济川药业集团有限公司,江苏 泰兴 225441)

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻ApocynumvenetumL.的干燥叶,具有平肝安神,清热利水的功能,可用于肝阳眩晕,心悸失眠,浮肿尿少等症[1]。现代研究表明[2-6]:罗布麻叶具有降血压、降血脂、保肝及抗抑郁等明显功效。其主要化学成分为黄酮类、鞣质类和有机酸类等[7]。本研究使用的罗布麻叶饮片来源于新疆地区,而新疆是罗布麻叶的主产区[8]。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经过水提、浓缩、干燥及制粒而成,经过中医临床配方后,供患者即冲即服的颗粒,这在很大程度上解决了传统中药煎煮复杂、不便携带且质量无保证的问题[9],但是我国对于中药配方颗粒的生产仍处于试验研究阶段,无统一的质量标准,因而无法确定产品的质量优劣。根据参考文献[10]要求,中药配方颗粒的原料、中间体和成品三者药效物质的指纹或特征图谱应保持一致性,并具有相关性。

但目前关于罗布麻叶的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱研究较多的是其药材或提取物的指纹图谱,而关于罗布麻叶配方颗粒的指纹图谱较少,且目前还没有对于罗布麻传统汤剂与配方颗粒HPLC指纹图谱相关性的研究报道。因此本研究利用HPLC法建立了罗布麻叶传统汤剂和配方颗粒的指纹图谱,并对其相关性进行了评价,以期为罗布麻叶配方颗粒生产过程质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AD型高效液相谱仪,色谱系统由DGU-20A5R型脱气机、SPD-20A型紫外可见检测器、S/L-20AHT UFLC型进样装置组成,日本岛津制作社;XSE205DU型电子分析天平,上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司;SY8200T型超声仪,上海声源超声波仪器设备有限公司。

1.2 材料

1.2.1 对照品

金丝桃苷(批号:110753-201415,纯度94.9%),槲皮苷(批号:100081-201610,纯度90.6%),中国食品药品检定研究院。

1.2.2 样品

罗布麻叶传统汤剂,批号:190414、190415和190416;罗布麻叶配方颗粒,批号:1907013、1908013和1908023,济川药业集团有限公司自制。

1.2.3 试剂

乙腈为色谱纯,H2O为超纯水,其余试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

Kromasil 100-5-C18,250 mm×4.6 mm，5 μm色谱柱;2 g/L 的H3PO4-乙腈溶液作为流动相,梯度洗脱程序见表1,其检测波长为360 nm,柱温为40 ℃,流速为1.0 mL/min,进样体积为10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3.2 供试品溶液的制备

精密量取罗布麻叶传统汤剂5 mL或精密称取配方颗粒0.5 g,置于具塞锥形瓶中,加体积分数50%乙醇溶液50 mL,称质量,超声处理60 min(功率200 W,频率58 kHz),放冷,称质量,用体积分数50%的乙醇溶液补足减损质量,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

1.3.3 对照品溶液的制备

1)金丝桃苷对照品溶液的制备

精密称取金丝桃苷对照品适量,用甲醇制备成1 mL含金丝桃苷36 μg的对照品溶液,即得。

2)槲皮苷对照品溶液的制备

精密称取槲皮苷对照品适量,用甲醇制备成1 mL含槲皮苷1 mg的对照品溶液,即得。

1.3.4 方法学考察

1)耐用性试验

取同一批次罗布麻叶传统汤剂,按1.3.2节中的方法制备供试品溶液,分别进行色谱柱、柱温以及流速耐用性试验。色谱柱包括:Kromasil 100-5-C18,250 mm×4.6 mm，5 μm;Agilent ZORBAX SB-Phenyl,250 mm×4.6 mm,5 μm;Phenomenex Luna C18100A,250 mm×4.6 mm,5 μm;Waters Xselect HSS T3,250×4.6 mm,5 μm;柱温包括35、40及45 ℃;流速包括0.8、1.0及1.2 mL/min;其余色谱条件同1.3.1节,测定HPLC色谱图,计算相似度。

2)进样精密度试验

取同一批次罗布麻叶传统汤剂,按1.3.2节中的方法制备供试品溶液,按1.3.1节中的条件测定,连续进样6次,测定HPLC色谱图,计算相似度。

3)重复性试验

取同一批次罗布麻叶传统汤剂,按1.3.2节中的方法平行制备6份供试品溶液,按1.3.1节中的条件分别进样,测定HPLC色谱图,计算相似度。

4)稳定性试验

取罗布麻叶传统汤剂,按1.3.2节中的方法制备供试品溶液,按1.3.1节中的条件分别于0、2、4、6、8、12、18、24和48 h进样,测定HPLC色谱图,计算相似度。

5)共有峰的辨识

取罗布麻叶传统汤剂,按1.3.2节中的方法制备供试品溶液,按2.3节中的方法制备对照品溶液,按1.3.1节中的条件分别进样,测定HPLC色谱图。

6)样品的测定

分别取3批罗布麻叶传统汤剂、罗布麻叶配方颗粒,按1.3.2节中的方法制备供试品溶液,按1.3.1节中的条件分别进样,测定HPLC色谱图。

2 结果与讨论

2.1 耐用性试验结果

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)[11]计算各条件下指纹图谱的相似度。色谱柱耐用性试验结果见表2。由表2可知：表中各数据表示此行此列所对应的两种色谱柱之间的相似度。以第一行为例(从左至右)，Kromasil与Kromasil品牌结果之间的相似度为1.000，Kromasil与Agilent品牌结果之间的相似度为0.951，Kromasil与Phenomenex品牌之间的相似度为1.000，Kromasil与Waters品牌结果之间的相似度为1.000。综上，4种色谱柱HPLC指纹图谱相似度对比结果均大于0.950，表明各色谱柱耐用性良好。

表2 色谱柱耐用性相似度

柱温耐用性试验结果见表3。由表3可知：表中各数据表示此行此列所对应的两种色谱柱温度之间的相似度。以第一行为例(从左至右)，35与35 ℃条件下结果之间的相似度为1.000，35与40 ℃条件下结果之间的相似度为0.998，35与45 ℃条件下结果之间的相似度为1.000。综上，表3中不同柱温条件下HPLC指纹图谱相似度对比结果均大于0.990，表明各柱温耐用性良好。

表3 柱温耐用性相似度

流速耐用性结果见表4。由表4可知：表中各数据表示此行此列所对应的两种色谱柱温度之间的相似度。以第一行为例(从左至右)，0.8 mL/min与0.8 mL/min条件下的流速结果之间的相似度对比结果为1.000，0.8 mL/min与1.0 mL/min条件下流速结果之间的相似度为1.000，0.8 mL/min与1.2 mL/min条件下流速结果之间的相似度对比结果为1.000。以上可知，流速HPLC指纹图谱相似度为1.000。综上， 表4中各流速面相比结果均良好。

表4 流速耐用性相似度

方法学试验中,各耐用性试验结果良好,其中色谱柱耐用性相似度偏低,但最低相似度仍能达到0.950,最后选择了Kromasil 100-5-C18色谱柱,是因为此色谱柱分离度较好且无显著拖尾现象;进样精密度、重复性和稳定性试验的共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于3%,说明该种方法进样精密度、重现性和48 h内稳定性均良好。以上结果表明：该方法可被应用于罗布麻叶传统汤剂指纹图谱。

在对罗布麻叶传统汤剂指纹谱图摸索试验中,首先对流动相的体系进行了考察,先考察了乙腈-水、甲醇-水两个系统,发现甲醇-水系统分离效果不如乙腈-水系统,考虑到罗布麻叶中含有黄酮类和酚类物质,在流动相中加入离子抑制剂来抑制酚羟基离子化[12],如醋酸、H3PO4和甲酸,结果表明：H3PO4-乙腈的分离效果最为理想。样品检测时采用PDA检测器对供试品溶液进行全波长扫描,全面考察不同吸收波长的色谱图,重点考察了256和360 nm处的谱图特征,结果显示：360 nm处色谱信息丰富,基线更加平稳,故选择360 nm作为吸收波长。提取条件方面,考虑到便捷性采用超声提取法。因罗布麻叶配方颗粒提取溶剂为H2O,故分别使用H2O、体积分数50%乙醇、体积分数75%乙醇、体积分数90%乙醇和相同浓度的甲醇进行提取,结果显示：相同浓度甲醇与乙醇作为提取溶剂无显著差异,考虑到甲醇具有毒性故选择乙醇,且采用体积分数50%乙醇提取的色谱图分离效果好,故选择体积分数50%乙醇作为提取溶剂。

2.2 方法学验证结果

2.2.1 进样精密度试验结果

进样精密度试验结果中,试验共标定7个共有峰,以1号峰为参照峰,计算其余6个共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD)值,结果见表5和6。如表5所示：各峰相对保留时间RSD值均小于1.00%；如表6所示：各峰相对峰面积RSD值均小于1.00%,以上均说明该方法进样精密度良好。

表5 进样精密度试验共有峰的相对保留时间

表6 进样精密度试验共有峰的相对峰面积

2.2.2 重复性试验结果

重复性试验结果中,试验共标定7个共有峰,以1号峰为参照峰,计算其余6个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值,结果见表7和8。如表7所示：各峰相对保留时间RSD值均小于1.00%。如表8所示：各峰相对峰面积RSD值均小于等于3.00%；以上均表明该方法重现性良好。

表7 重复性试验共有峰的相对保留时间

表8 重复性试验共有峰的相对峰面积

2.2.3 稳定性试验结果

稳定性试验结果中,试验共标定7个共有峰,以1号峰为参照峰,计算其余6个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值,结果见表9和10。如表9所示：各峰相对保留时间RSD均小于1.00%。如表10所示：各峰相对峰面积RSD均小于1.00%,以上均表明该方法48 h内稳定性良好。

表9 稳定性试验共有峰的相对保留时间

表10 稳定性试验共有峰的相对峰面积

2.3 色谱峰的辨认结果

相同色谱条件下,金丝桃苷、槲皮苷与罗布麻叶传统汤剂指纹图谱各色谱峰比较,发现罗布麻叶传统汤剂指纹图谱中的1号峰、4号峰与金丝桃苷、槲皮苷保留时间吻合,故将罗布麻叶传统汤剂指纹图谱中的1号峰、4号峰分别鉴定为金丝桃苷、槲皮苷，对比情况见图1，这与《中国药典》2015年版第一部中罗布麻叶的含量测定项为金丝桃苷相一致[13-14]。

图1 罗布麻叶传统汤剂对照指纹图谱Fig.1 Reference HPLC fingerprints of traditional decoction of Apocynum venetum leaves

现代研究表明,黄酮类化合物是罗布麻叶中最重要的活性成分,例如金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素和槲皮苷等。前期研究还发现[13-14]：罗布麻叶配方颗粒指纹图谱中可以指认出槲皮素,但在罗布麻叶传统汤剂指纹图谱中未出现,原因可能是罗布麻叶传统汤剂浓度较低,物质含量少,未达到检测限;罗布麻叶饮片指纹图谱中指认出绿原酸,但在罗布麻叶传统汤剂和配方颗粒液相色谱图中绿原酸对应的保留时间处有两个峰叠加在一起,极有可能是罗布麻叶经过煎煮后与绿原酸结构相似的物质有所增加,具体情况仍有待进一步探讨。

2.4 样品的测定结果

将罗布麻叶传统汤剂和罗布麻叶配方颗粒HPLC指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)[11],比对后发现,罗布麻叶传统汤剂的7个共有特征峰,在罗布麻叶配方颗粒中均有显示,且通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)[11],计算了各样品共有色谱峰与标准模式中对应的色谱峰的相似度,发现对照指纹图谱相似度均大于0.950。图2为罗布麻叶配方颗粒与传统汤剂指纹图谱对比图。由图2可知：罗布麻叶传统汤剂的7个共有特征峰在罗布麻叶配方颗粒中均有显示，说明罗布麻叶配方颗粒在生产过程中的主要物质种类与传统汤剂相一致。表11为HPLC指纹图谱相似度，由表11可知：通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)[11]，计算了各样品共有色谱峰与标准模式中对应的色谱峰相似度，发现各配方颗粒、传统汤剂与对照指纹图谱相似度均大于0.950。表格中的数据表示此行此列所对应的两种物质之间的相似度，以第一行为例，前3个1.000分别为配方颗粒1与配方颗粒1、配方颗粒2、配方颗粒3结果之间的相似度，0.901为配方颗粒1与传统汤剂1结果之间的相似度，0.926为配方颗粒1与传统汤剂2结果之间的相似度，0.918为配方颗粒1与传统汤剂3结果之间的相似度，0.981为配方颗粒1与对照指纹图谱之间的相似度。

S1为1907013批罗布麻叶配方颗粒;S2为1908013批罗布麻叶配方颗粒;S3为1908023批罗布麻叶配方颗粒;S4为190414批传统汤剂;S5为190415批传统汤剂;S6为190416批传统汤剂图2 罗布麻叶配方颗粒与传统汤剂指纹图谱对比图Fig.2 Comparison on HPLC fingerprints of formula granules and traditional decotion of Apocynum venetum leaves

表11 HPLC指纹图谱相似度

3 结论

通过对罗布麻叶传统汤剂以及配方颗粒的HPLC指纹图谱相关性进行研究,阐明了罗布麻叶配方颗粒在生产过程中与传统汤剂的成分基本保持一致。本试验将罗布麻叶传统汤剂和罗布麻叶配方颗粒的指纹图谱通过系统处理后,发现对照指纹图谱相似度大于0.950,说明罗布麻叶配方颗粒与罗布麻叶传统汤剂的相似度很高,且两者均有相同的7个共有峰,因此能够确定两者成分基本保持一致,且具有良好的相关性,该HPLC指纹图谱可应用于罗布麻叶配方颗粒生产过程,以监控其质量变化,为罗布麻叶配方颗粒工业化生产提供了有关科学依据。