基于综合数据库分析ASXL1基因突变对子宫内膜癌预后的影响及作用机制

范玥 韩馨乐 杜俊

子宫内膜癌（Endometrial carcinoma，EC）是女性第六大常见的恶性肿瘤。近年来，发病率持续上升并呈现年轻化趋势，严重威胁女性健康[1]。根据2015年中国癌症数据分析显示子宫内膜癌预计年发病率为60/10万，死亡率约为20/10万，发病率也呈逐年上升趋势[2]。2013年，人类癌症基因组图谱（The cancer genome atlas，TCGA）根据不同突变方式和拷贝数将EC划分为4种分子分型，即POLE（DNA聚合酶ε）突变型、微卫星不稳定高突变型、低拷贝数型和高拷贝数型。该分子分型对预后判断及精准治疗有重要意义，但也存在局限性[3，4]。在肿瘤精准治疗的背景下，探讨基因突变的预后意义及作用机制，对靶向治疗的靶点选择具有重要参考意义。ASXL1（Additional sex combs like 1）基因首次于2009年在骨髓增生异常综合征（MDS）中报道[5]，其位于染色体20q11，靠近DNMT3B基因[6]，由12个外显子组成。根据既往研究，ASXL1基因突变在血液系统髓系肿瘤中是预后不良的生物学标志物[7]，包括骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征（MDS）、慢性粒单核细胞白血病（CMML）和急性髓系白血病（AML）等。然而，ASXL1在EC中的预后意义鲜有报道，其相关机制仍有待研究。本研究旨在通过多种肿瘤综合数据库，分析ASXL1基因突变在EC患者中的预后意义及可能的作用机制，为EC的精准治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源与方法基于GEPIA数据库（http://gepia.cancerpku.cn/）分析ASXL1基因突变在EC患者中的预后意义及其与临床分期的关系。同时，通过获取在EC中与ASXL1有相似表达特征的前200个基因，对其信号通路相关性及蛋白质互作网络做了进一步分析。

基于Kaplan-Meier plotter数据库（https://kmplot.com/analysis/），汇总ASXL1基因突变在EC患者中的预后意义，包括总生存期（Overall survival，OS）与无复发生存期（Relapse-free survival，RFS）。通过将ASXL1基因突变截分为高低两组，比较两组的生存差异，并进一步计算危险比（Hazard ratio，HR）、95%置信区间（95%CI）以及P值。

基于FireBrowse网站（http://www.firebrowse.org/），分析ASXL1的基因表达、DNA甲基化、拷贝数变异和突变状态。同时，基于人类蛋白质图谱图像分类数据库（Human Protein Atlas），ASXL1的组织、器官分布情况得以呈现，也对ASXL1的亚细胞定位进行分析。

STRING数据库（https://string-db.org/）作为在线检索已知蛋白质互作关系的数据库，可对直接或间接的蛋白质互作网络进行功能分析。基于STRING数据库，纳入50个表达量相对较高的相关因素，结合Cytoscape软件，进行蛋白质互作网络分析（Protein-protein interaction network，PPI）。纳入分析的最小相关性分数为0.400。

UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu）是基于TCGA数据库在线分析和挖掘的网站。分析ASXL1基因在不同种族、年龄、更年期状态以及组织学亚型EC患者中的表达水平。

DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）是基于Annotation Tool，GoCharts，KeggCharts以及Domain Charts四个分析模块实现对数据的注释、可视化和集成发现，从而实现基因组规模数据集的分析。通过其在线分析功能，对ASXL1基因突变密切相关的生物学过程以及富集的信号通路进行初步探究。

1.2 统计学方法采用SPSS 25.0软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用双侧t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EC患者中ASXL1基因突变状态及分布差异GEPIA数据库检索结果显示ASXL1基因在多种肿瘤组织中异常表达，其中在EC中表达降低，见图1。UALCAN数据库检索结果显示ASXL1基因在不同种族、年龄、更年期状态以及组织学类型中的分布差异。与正常组相比，年龄21～40岁组和41～60岁组中ASXL1基因水平有所降低（P＜0.001），各种族人群比较显示高加索人群中EC患者ASXL1基因水平低于正常人群（P＜0.001），其余人种无统计学差异。绝经前人群中EC患者ASXL1基因水平明显低于正常对照组（P＜0.001）。根据不同组织学亚型进行分组，EC中ASXL1基因水平明显降低，而浆液性癌与之相反（P＜0.001），见图2。

图1 不同肿瘤类型与正常对照组织中ASXL1基因的表达情况

图2 ASXL1基因在不同年龄、组织学类型、更年期状态以及种族间的分布差异

利用The Human Protein Atlas数据库追踪ASXL1基因的亚细胞定位，发现ASXL1基因主要定位于细胞的核质和核仁。通过FireBrowse网站分析了538例EC患者的基因表达情况，发现突变水平较高的基因主要包括PTEN、PIK3CA、ARID1A、PIK3R1、CTNNB1、TP53、KRAS等，其突变类型主要为无义突变和错义突变。

2.2 ASXL1基因突变在EC预后中的意义通过Kaplan-Meier Plotter数据库根据log-rank法及生存曲线比较，显示升高的ASXL1 mRNA水平与缩短的OS及RFS相关（P＜0.001）。通过GEPIA数据库检索结果发现ASXL1突变在不同时期肿瘤中存在差异，处于疾病进展期（Ⅲ、Ⅳ期）的EC患者较疾病初期（Ⅰ、Ⅱ期）的患者有所升高，见图3。

图3 ASXL1基因表达水平与OS、RFS及肿瘤分期之间关系

2.3 EC患者中ASXL1基因的突变状态及功能预测在GEPIA数据库检索，获取TCGA及GTEx测序数据中前200位与ASXL1有相似表达特征的基因，并通过Pearson相关系数对这些基因进行排序。采用GO分析及KEGG分析对ASXL1突变相关基因进行功能富集分析及信号通路预测。通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），发现与ASXL1突变密切相关的生物学过程主要包括DNA转录、RNA处理、RNA剪接等；蛋白质结合、组蛋白结合、DNA结合、转录共激活因子活性、序列特异性DNA结合等分子功能的改变与ASXL1基因突变有关；而核质、驱动蛋白复合物等细胞组分的改变与ASXL1基因异常表达有关。通过KEGG分析，这些相关基因突变主要与mTOR信号通路调节相关。见图4。

图4 GO分析与ASXL1基因异常表达有关的生物学过程（左）、细胞组分（中）和分子功能（右）之间的关系

2.4 PPI及ASXL1基因的相关性分析选取前50位与ASXL1有相似表达情况的相关基因，通过STRING数据库（https://string-db.org/）在线分析以及Cytoscape软件的可视化绘图，进行了PPI分析。表观遗传学相关改变与ASXL1存在相互作用关系，包括HDAC2、DNMT3A、CBX家族以及TET2，见图5。另外，在GEPIA数据库中，通过TCGA及GTEx的数据集对ASXL1突变存在密切关系的基因做相关性分析。ASXL1基因突变与PTEN、PIK3CA、JAK2、STAT3及TET2多个基因存在正相关，其中PTEN（r=0.55，P＜0.001）、PIK3CA（r=0.73，P＜0.001）、JAK2（r=0.66，P＜0.001）、STAT3（r=0.6，P＜0.001）以及TET2（r=0.63，P＜0.001），见图6。

图5 ASXL1与相似基因表达的蛋白质互作图

图6 TET2、PTEN、PIK3CA、JAK2、STAT3基因与ASXL1表达的相互关系

3 讨论

本研究显示ASXL1在EC中存在基因突变。通过GEPIA和Kaplan-Meier plotter数据库的生存分析发现ASXL1基因突变是EC的不良预后因素，与OS和RFS均存在相关。虽然ASXL1基因突变在EC中的预后价值极少报道，但从公共数据库的大样本分析看，该基因的突变状态确实对生存造成了威胁。作为肿瘤抑制基因，ASXL1的缺失也是结直肠肿瘤（Colorectal cancer，CRC）中的不良预后因子[8]。有学者在结直肠样本（408例结直肠癌、46例正常结肠粘膜、48例腺瘤及92例癌性淋巴结）中发现，ASXL1的缺失造成5年生存率明显低于正常组（78.7%±2.5% vs 100%，P=0.034）。并且，在结直肠正常组织→腺瘤→腺癌→癌性淋巴结转移发展的过程中，ASXL1基因缺失的比例也逐渐增加[8]。这表明ASXL1作为抑癌基因的缺失状态是肿瘤患者的不良预后因素，其可能与淋巴结转移相关，使得疾病更具侵袭性。在我们的分析中，ASXL1突变不仅是预后不良因素，且在疾病晚期的患者中突变率显著升高。这提示在EC中ASXL1突变同样与疾病严重程度相关，是评判临床预后的重要指标。

ASXL1基因突变如何发挥功能、影响预后，仍然缺乏可靠的基础生物学研究。通过GO分析及KEGG分析，我们发现ASXL1参与的生物学过程主要包括DNA转录、RNA处理、RNA剪接等。结合相关性分析可以发现ASXL1与PTEN、PIK3CA、JAK2及STAT3基因存在相关性，ASXL1可能与PI3K/mTOR信号通路调节有关。众所周知，PI3K/AKT/mTOR细胞内信号传导途径调节重要的细胞周期。PI3K（The phosphatidylinositol 3-kinase）是一类高度保守的酶家族，是胞内PI3K/AKT/mTOR信号轴的重要组成部分。PI3K/AKT/mTOR信号通路在细胞的生长、分化、凋亡等方面都发挥着重要作用，其中信号转导的很多成员分子，都是癌症、免疫及控制血栓形成等过程中的关键药物靶点[9]。PI3K激活磷酸化并激活AKT，使其定位在质膜上。AKT可以具有许多下游效应，如激活CREB，抑制p27，在细胞质中定位FOXO，激活PtdIns-3ps和激活mTOR可能会影响p70或4EBP1的转录。而肿瘤抑制基因PTEN能够通过去磷酸化而使PIP3变为PIP2，是该通路的负性调节因子[10]。在我们的分析中，ASXL1基因突变与PI3K/AKT/mTOR信号通路激活相关，且与PTEN基因突变存在正相关性，表明两者可能发挥了协同致病的效应，共同导致疾病不良预后。

近年来，肿瘤的分子生物学检测尤其是高通量测序，为精准治疗创造了必要条件[11～13]。基于我们对EC的肿瘤数据库挖掘，以及生物信息学预测，干预PI3K/AKT/mTOR信号通路可能为患者治疗带来益处，尤其是对复发/转移的EC患者。PI3K存在4种异构体，其信号协同有所差异，但最终与PTEN突变有重要关系，导致癌症发生。PI3K下游存在两条重要通路，其中FOXO主要与细胞分化有关，而mTORC主要与细胞增殖有关[14]。目前关于PI3K/AKT/mTOR信号通路的靶向干预治疗报道较多，包括单独或联合靶向PI3K异构体以及靶向mTOR的药物[15]。目前临床可及的药物包括PI3K抑制剂（Idelalisib、Infinity等）及mTOR抑制剂（雷帕霉素）。由于诸多恶性肿瘤中普遍存在PI3K/AKT/mTOR信号通路异常，包括实体瘤和血液恶性肿瘤[9]，故而以该通路为靶点研发肿瘤抑制剂也是研究热点。但是，在其他实体肿瘤的研究中，我们发现PI3K/AKT/mTOR单靶点抑制剂很难产生显著、可持续的治疗效应，而联合用药成为重要的研究方向[16～18]。目前，探索PI3Kα/mTOR双靶点药物如NVP-BEZ235、PI3Kα/δ/γ/PDK1双靶点抑制剂等，均在实体肿瘤及血液病研究中存在巨大潜力，可能有可观的临床疗效，具备应用前景[19]。

本研究通过肿瘤综合数据库，发现ASXL1基因突变与EC患者不良预后有关，是重要的临床预后参考指标，动态监测基因突变状态也有助于评估疾病进展状态。同时，通过生物信息学分析，我们发现ASXL1基因突变可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路调节有关，这表明靶向该通路的抑制剂可能成为潜在有效的治疗方式，尤其是对于复发/进展的患者。不过本研究仍存在局限性：①本研究纳入的人群为EC患者，来自于特定的国家和地区，可能缺乏种族特异性；②本研究通过公共数据库生物信息学分析，缺乏严谨可靠的生物学验证，其真实性仍然值得进一步研究；③基因测序的数据样本量中等，在真实世界能否重现ASXL1突变的临床预后意义，需要临床队列进行验证。

综上所述，我们通过多个肿瘤相关数据库，发现ASXL1基因突变是EC患者的不良预后因素，显著影响OS及RFS，且与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。靶向该通路可能成为新的治疗选择，为复发/进展的EC患者带来福音[20]，但需要严谨的生物学验证以及前瞻性的临床试验证实。总之，探索ASXL1基因突变的预后意义及作用机制，可能成为未来EC精准治疗的新研究方向。