开口箭根状茎提取物对椪柑贮藏品质的影响

姚姝凤, 许嘉琍, 高 宏, 汪春学, 张海波, 商士斌*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;生物质化学利用国家工程实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;江苏省生物质能源与材料重点实验室,江苏 南京 210042;2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210037;3.长春市生态环境保护研究所,吉林 长春 130041)

柑橘类水果在世界上广泛种植且产量丰富[1]，其口感多汁，富含维生素，营养价值高，深受消费者青睐。然而，柑橘采后会由于蒸腾作用失去水分，同时由于呼吸作用等代谢活动消耗有机物，还会受到微生物的侵染而腐烂，失去商业和食用价值[2]。涂膜保鲜是柑橘采后贮藏常用的保鲜方法[3]。生物质涂膜保鲜剂覆盖在果品表面，能形成薄膜，可抑制水分蒸发，调节呼吸作用，具有无毒、来源广泛的优点[4]。被膜剂和抑菌剂是涂膜保鲜剂中两个重要组分。松香树脂具有易成膜，价格便宜等特点，且对柑橘、草莓等采后水果具有良好的保鲜效果[5-6]，可用作被膜剂。抑菌剂能有效抑制真菌侵染而产生的采后病害，是涂膜保鲜剂中的另一个重要的组分。柑橘采后易受真菌如指状青霉(Penicilliumdigitatum)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、白地霉(Geotrichumcandidum)等侵染，分别产生绿霉病、青霉病和酸腐病，且在货架期内黑曲霉(Aspergillusniger)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)也会引起柑橘腐烂[7-9]。控制真菌病害、延缓腐烂速率，能有效提高柑橘的商业价值、延长货架期。目前，使用化学抑菌剂对柑橘进行防腐处理是应用最为广泛的防腐方法[10]。传统的人工合成的化学抑菌剂易残留、不易降解且成分单一，长期使用易使真菌对其产生抗药性，大量使用会对人类健康和生态环境造成一定的威胁，如多菌灵在我国使用广泛，但其残留可能引起肝病和染色体畸变，对哺乳动物有害[11]。生物质抑菌剂，由于具有毒性小、对人和动物等非靶标生物危害小、环境友好等特点，因此能成为化学抑菌剂的良好替代品，引起国内外学者的广泛关注[12-14]。当前对天然产物中的抑制水果致腐真菌的活性成分的研究主要为精油类[15-16]，但精油类价格昂贵、其气味影响水果风味等问题限制了其在水果保鲜上的应用[17]。开口箭(TupistrachinensisBaker)是我国民间药用植物，其提取物对荔枝霜疫霉菌及香蕉炭疽病菌等具有一定的抑制作用[18-19]。前期研究发现，开口箭根状茎提取物对指状青霉等多种霉菌具有抑制作用[20]，且从开口箭中分离得到的甾体皂苷具有良好的抑制指状青霉和匍枝根霉活性[21]。因此，本研究将开品箭根状茎提取物作为抑菌剂，以松香树脂(RAE)为被膜剂[5]，用于椪柑涂膜保鲜，考察了开口箭根状茎提取物对椪柑外观品质、生理生化指标及防御性酶活性的影响，以期为天然防腐保鲜剂的开发提供依据。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

开口箭根状茎购自湖北神农架中药店，经吉首大学董爱文教授鉴定为TupistrachinensisBaker，标本(No.JIU04988)存于吉首大学植物标本馆。开口箭根状茎于50 ℃下烘干、粉碎待用。松香树脂(RAE)，以精制松香为原料，先与马来酸酐加成，引入亲水基团(—COOH)，再与戊四醇催化酯化反应得到水溶性松香树脂[5]。马铃薯葡萄糖培养基，北京三药科技发展有限公司。氢氧化钾、油酸等，均为市售分析纯。

指状青霉(Penicilliumdigitatum)ACCC 30389、黑曲霉(Aspergillusniger)ACCC 30005、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)ACCC 36973真菌菌株，中国农业科学研究院农业微生物菌种保藏管理中心。

椪柑，2018年12月7日采于江苏省苏州市东山镇的一个当地果园，成熟度八至九成。椪柑采后尽快运到实验室，挑选出大小、形状和果皮颜色大致相同，且无病虫害及机械损伤的柑橘。

TMS-PR质构仪，美国食品技术公司；PAL-1数字糖度计，日本ATAGO公司；TU1900紫外-可见分光光度计，中国北京浦肯野仪器有限公司；TGL-16M冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪，美国Thermo Scientific公司。

1.2 提取物的制备及抑菌性能测定

1.2.1制备 取开口箭根状茎粉末500 g，用95%乙醇浸泡过夜，液料比10 ∶1(mL ∶g)，60 ℃下提取3 h，重复提取3次，合并滤液，50～60 ℃减压浓缩得到浸膏。浸膏加适量的水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，每次萃取有机相与水相体积比约1 ∶1。所得石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取液分别于50～60 ℃减压浓缩得到浸膏，并于35～40 ℃下真空干燥至干，得石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)、正丁醇提取物(C)。

1.2.2抑制真菌活性 抑制真菌活性测定参考Matsuzaki等[22]和Wilson等[23]的方法。采用2倍连续微量稀释法，将96孔无菌酶标板中1～10列提取物最终质量浓度设定为2 500、 1 250、 625、 312.5、 156.25、 78.13、 39.06、 19.53、 9.77、 4.88 mg/L，真菌孢子悬浮液浓度为1×105个/mL，每孔总体积为200 μL。设置阴性对照，即溶剂对照，只含对应浓度的溶剂，不含提取物；阳性对照，提取物替换为等浓度的山梨酸钾和苯甲酸钠，用无菌盖覆盖微孔板并在(28±1) ℃的黑暗中培养72 h。在实验开始时和结束后，使用酶标仪在600 nm处测定每个孔的光密度(OD600)。所有实验设定3个平行实验，重复2次，计算抑制率，计算公式如下：R=[(ΔA0-ΔAt)/ΔA0]×100%，其中ΔA0为阴性对照光密度增量，即阴性对照组72 h的光密度和0 h时光密度差值；ΔAt为实验组或阳性对照组的光密度增量。半数抑制浓度(IC50)值采用GraphPad Prism 8计算。

1.3 保鲜剂的制备及椪柑处理

将RAE溶解在质量分数2%氢氧化钾水溶液中，配成质量分数10%的RAE被膜剂。分别取A、B、C，加少量乙醇溶解后，加入到RAE被膜剂中，配成提取物质量浓度为1 g/L的溶液，再分别滴加油酸调节pH值至7～8，制成保鲜剂AR、BR、CR，备用。柑橘清洗后，在室温下风干表面水分，随机分为5组：空白对照组，不涂膜，用清水处理；阴性对照组，用海绵擦在椪柑上均匀涂抹不加抑菌剂的RAE被膜剂；实验组1～3，分别用海绵擦在椪柑上均匀涂抹保鲜剂AR、BR和CR。处理后的椪柑，在室温下风干表面水分。所有椪柑在室温下贮藏36天，每6天取样一次，进行椪柑外观观察并测定其相关生理生化指标。

1.4 保鲜指标测定

1.4.1腐烂指数 腐烂指数参考Cao等[24]的方法计算。按椪柑腐烂程度，将其分为5个等级，其中0=无腐烂； 1=轻微感染，腐烂面积小于果表面积的1/8； 2=轻微腐烂，腐烂面积大于果表面积的1/8但小于1/4； 3=中度腐烂，腐烂面积大于果表面积的1/4但小于1/2； 4=严重腐烂，腐烂面积大于果表面积的1/2但小于果面的2/3； 5=全腐烂，腐烂面积大于果表面积的2/3。腐烂指数的计算公式如下：∑(i×Ni)/(imax×n)，其中i表示腐烂级别，Ni表示相应腐烂级别(i)的果实数，imax代表最高腐烂级别，n代表测量的果实总个数。

1.4.2失重率 称取贮藏前果实和贮藏后果实的质量，并按以下公式计算失重率：失重率=(贮藏前质量-贮藏后质量)/贮藏前质量×100%。

1.4.3果肉硬度 使用质构仪，用穿刺法测定果肉硬度。每组随机取5～6个果实，在每个果实两侧赤道区去果皮，测定其果肉硬度。穿刺试验使用3.5 mm圆柱探头，穿刺深度为10 mm，直接在仪器上读取硬度值，每个果实测定3个点，计算平均值，单位为N。

1.4.4可溶性固形物含量 椪柑果汁中可溶性固形物含量用数字糖度计测定。测定硬度后的果实，剥去果皮，用柠檬夹榨汁器挤出果汁，滴于数字糖度计测试槽，测量并记录结果，每组取5个果实进行测定，计算平均值。

1.4.5维生素C含量 维生素C含量用2，6-二氯靛酚滴定法测定[25]，维生素C的浓度根据2，6-二氯靛酚的消耗量计算。

1.4.6丙二醛含量 丙二醛含量参考文献[26]报道的方法测定。

1.4.7过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性 参考文献[27～29]中的测定方法，测定并计算椪柑果肉中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

2 结果与讨论

2.1 开口箭根状茎提取物抑制真菌活性

开口箭根状茎石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)和正丁醇提取物(C)对3种致腐真菌的抑制活性如表1所示。其中，B对指状青霉、黑曲霉和匍枝根霉的半数抑制浓度(IC50)分别为0.190、 0.262和0.238 g/L，小于其他2种提取物，抑制活性最强；其次为A，C的抑制真菌活性最弱。与阳性对照相比，B对指状青霉的抑制活性与苯甲酸钠和山梨酸钾的相差不大，对黑曲霉和匍枝根霉的抑制活性高于阳性对照苯甲酸钠，但略低于山梨酸钾。

表1 开口箭根状茎提取物抑制真菌活性

2.2 开口箭根状茎提取物对椪柑贮藏品质的影响

2.2.1腐烂指数 腐烂是影响水果贮藏品质、造成经济损失的最重要因素。降低腐烂速率对于保持水果品质，延长货架期尤为重要。不同处理方式的椪柑腐烂指数如图1(a)所示，随着储藏时间的增加，5组椪柑的腐烂指数均不断上升。在贮藏18天左右，空白对照和阴性对照组(RAE)腐烂指数迅速增加，而添加AR和BR的处理组上升趋势不明显，说明AR或BR能有效降低椪柑的腐烂率。添加CR的处理组腐烂指数在前期与空白对照及阴性对照相比较低，而后期(24天后)防腐效果较差。表明，在RAE中添加A或B能有效降低椪柑腐烂率，椪柑储藏36天后，腐烂指数分别为10.6%和7.2%，分别较空白对照(16.7%)降低6.1和9.5个百分点。可见，添加AR或BR的保鲜剂具有良好的防腐活性。

2.2.2失重率 水果采后会因蒸腾作用失水，且呼吸作用等新陈代谢会消耗有机物[30]，使总质量减轻，即失重率相应升高。因此，失重率是评价水果新鲜度的另一个重要指标。不同处理方式的椪柑失重率随贮藏时间的变化如图1(b)所示，在RAE中添加A或B进行处理的AR和BR组的失重率明显低于空白对照组，略低于阴性对照组。而RAE中添加C的CR组与空白对照组相比失重率降低，但与阴性对照组相比，差异不明显。总体来看，RAE在防止果皮水分蒸发方面起到关键作用，而在其中添加A或B，其失重率与空白对照组相比降低更加显著。这是由于微生物侵染水果后，会消耗水果本身的有机物，添加A或B作为抑菌剂后，椪柑在贮藏后期受微生物作用影响小，这部分失重不显著。

图1 开口箭根状茎提取物对椪柑腐烂指数(a)、失重率(b)和果肉硬度(c)的影响

2.2.3果肉硬度 椪柑在贮藏初期由于细胞壁物质的分解作用，果肉细胞离散，组织变软，硬度逐渐下降[31]。而贮藏30天后，柑橘大量失水，柑橘果实变干、化渣性差，逐渐出现轻微枯水症状[32]，硬度上升。这种现象在枇杷贮藏过程中也会出现[33]。由图1(c)可以看出，在贮藏18天中，添加AR、BR和CR的处理组，硬度稍高于空白对照组但与阴性对照组差别不大，说明其果肉饱满度较高，新鲜度强，且可能RAE起到主要的保鲜作用。而贮藏30天后，空白对照组的硬度迅速上升，RAE中添加A、B或C的处理组硬度上升较慢，且略低于阴性对照组。说明添加开口箭根状茎提取物后，对于保持椪柑新鲜度起到一定的作用，能够延缓“枯水症”发生。

2.2.4可溶性固形物含量 可溶性固形物(主要为可溶性糖)含量是反映果品成熟度和品质状况的指标[28]。果品在成熟过程中，可溶性固形物含量逐渐增加。由图2(a)可以看出，所有椪柑可溶性固形物含量在36天贮藏期间变化不明显，基本为10%～12%，可能由于椪柑成熟度较高，因此可溶性固形物含量变化不大，且添加开口箭根状茎提取物对柑橘贮藏期间可溶性固形物含量几乎无影响。

2.2.5丙二醛含量 丙二醛(MDA)是生物膜脂质过氧化最重要的产物之一，MDA的积累可能对生物膜和细胞造成一定的伤害[34]，因此可通过测定MDA含量了解膜脂过氧化程度，以间接测定生物膜系统受损程度以及植物的抗逆性。从图2(b)中可以看出，在储存36天期间，丙二醛含量基本呈上升的趋势。在贮藏30天后，空白对照组的丙二醛含量上升非常显著，而处理组上升趋势相对缓慢。说明添加开口箭根状茎提取物A、B、C能在储藏后期延缓丙二醛含量上升，有助于保持水果的新鲜度。

2.2.6维生素C含量 维生素C是柑橘类水果的重要营养成分。由图2(c)可以看出，随着贮藏时间的延长，维生素C的含量基本呈现下降趋势，在贮藏18天内下降较快，后期下降速度较慢。添加C的保鲜剂处理组的椪柑在前期保持较高的维生素C含量，而后期下降速度加快。而添加AR或BR保鲜剂处理的椪柑中维生素C含量下降较慢，在贮藏36天后，平均量保持在0.024%左右。

图3 开口箭根状茎提取物对椪柑过氧化氢酶(a)、过氧化物酶(b)和超氧化物歧化酶(c)活性的影响

综上所述，添加BR保鲜剂使椪柑果实的抗氧化酶活性峰值延后，在贮藏后期，抗氧化酶活性保持较高的水平，说明以BR处理椪柑能延缓椪柑果实衰老，使果实保持对外界环境的抗性。

3 结 论

3.1考察了开口箭根状茎的石油醚提取物(A)、乙酸乙酯提取物(B)和正丁醇提取物对3种真菌：指状青霉、黑曲霉和匍枝根霉的抑制作用。研究发现，开口箭提取物对3种真菌都具有一定的抑制作用，其中，B对3种真菌抑制活性最强。

3.2以松香树脂为被膜剂，A、B、C为抑菌剂，制成了保鲜剂AR、BR和CR，考察了添加开口箭根状茎提取物的松香基保鲜剂对椪柑的防腐保鲜效果。研究发现，添加AR和BR保鲜剂能有效降低椪柑的腐烂率、延缓丙二醛含量的升高以及维生素C含量的降低，且添加BR能提高果实抗氧化酶的活性，而在失重率和果肉硬度方面，RAE起到主要保鲜作用，所有涂膜组对可溶性固形物含量几乎无影响。可见，被膜剂中添加B对椪柑具有良好的防腐保鲜作用，有望在柑橘涂膜保鲜剂中加以应用。