酶法制备桃叶珊瑚苷元及其稳定性研究

曹金腾， 吴 涛， 董玉蓉， 仇 聪， 姜 艳， 赵林果*

(1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.南京林业大学 化学工程学院，江苏 南京 210037)

杜仲是杜仲科杜仲属植物，有较高的药用价值和经济价值[1]，含有效活性成分达200余种，主要包括黄酮类、环烯醚萜类、多酚类、苯丙素类、多糖类等[2]。桃叶珊瑚苷是杜仲籽中主要的环烯醚萜苷类成分，具有舒张血管[3]、护肝解毒[4]、抗氧化[5]、抗骨质疏松[6]、延缓光老化[7]等多种药理活性，但其口服生物利用度低(19.3%)[8]，难以被肠道吸收，需水解为桃叶珊瑚苷元来发挥疗效。另一方面，桃叶珊瑚苷元的生理活性比桃叶珊瑚苷高很多[9]。因此，体外将桃叶珊瑚苷制备为桃叶珊瑚苷元，将大大提高桃叶珊瑚苷的生物利用度、药理活性及其附加价值。目前，桃叶珊瑚苷元的制备方法有酸水解法和酶水解法，其中酶水解法具有反应条件温和、专一性强等优势。但是酶水解法存在两方面问题，一是酶催化效率不高、酶学性质不适合催化体系的环境[9]；二是桃叶珊瑚苷和桃叶珊瑚苷元稳定性差，特别是桃叶珊瑚苷元含有闭环环戊二烯吡喃型半缩醛结构，极易发生氧化聚合反应，因此，难以大量制备纯度较高的桃叶珊瑚苷元[10]。国内外的相关研究表明，酶的催化转化反应可以在水相中进行，也可以在非水相催化体系中进行[11]，采用有机溶剂-水双相体系反应可以减少副反应的进行，提高苷元产率。Yu等[12]在双相体系中制备薯蓣皂苷元，苷元产率大幅提高；沈玉萍[13]采用双相酸水解法制备槲皮素，产率比传统方法提高了39%。所以，采用有机溶剂-水双相体系有望能提高酶的催化效率、改善桃叶珊瑚苷元在酶解及分离过程中的稳定性。在桃叶珊瑚苷元稳定性方面，尽管国内外对桃叶珊瑚苷稳定性影响因素及如何提高其稳定性做了一些研究[14-15]，但效果都不太理想，而且对苷元稳定性分析还不够深入。本课题组自主研发了一种β-葡萄糖苷酶[16]，能有效水解桃叶珊瑚苷获得苷元。在此基础上，本研究优化了单水相和正丁醇-水双相的酶解条件，分析了温度、pH值、抗氧化剂VC浓度和有机溶剂种类等因素对桃叶珊瑚苷元稳定性的影响，以期为后续桃叶珊瑚苷元高效制备、保藏和利用提供技术支撑。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

桃叶珊瑚苷，江苏永健医药科技公司；桃叶珊瑚苷元，成都普瑞法科技开发有限公司；4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷(pNPG)，Sigma公司；酵母提取物、蛋白胨，阿拉丁公司；D-生物素(D-Biotin)，生工生物工程股份有限公司；抗生素Zeocin、无氨基酵母氮源，南京天为公司。甲醇，色谱级；其他试剂均为国产分析纯。β-葡萄糖苷酶由重组毕赤酵母菌pPICZαA-bgl1高效表达获得；基因来源于黑曲霉Aspergillussp.NL-1；重组酶为南京林业大学微生物技术研究室研发，酶制剂制备及酶活力测定参照文献[16]。酶活力单位(U)定义：在酶的最适温度和pH下反应，每分钟水解相应底物pNPG释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量。

ZHWY-10X水浴摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；酶标仪spectraMax190，美国分子仪器公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.2 单水相酶解桃叶珊瑚苷条件的优化

精确吸取桃叶珊瑚苷溶液20 μL(50 mmol/L)、一定量的β-葡萄糖苷酶酶液和柠檬酸缓冲溶液(pH值4.5，500 mmol/L)总体积共200 μL，置于离心管中，在设定温度下水浴酶解一定时间，分别考察酶用量、酶解时间和反应温度对单水相酶解桃叶珊瑚苷的影响。反应结束后，将酶解液置于冰上，向其中加入400 μL的甲醇溶液涡旋混匀终止酶解反应，混合溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，收集滤液进行HPLC分析并计算桃叶珊瑚苷元产率。

1.3 双相体系酶解桃叶珊瑚苷条件的优化

分别吸取1 mL桃叶珊瑚苷溶液(50 mmol/L)与酶液(25 U/mL)的混合溶液置于5 mL离心管中，取样，经HPLC测定初始浓度；加入1 mL不同体积分数的有机溶剂置于摇床设定温度下250 r/min振荡酶解一定时间后，分别考察有机溶剂种类及其体积分数、反应时间、反应温度对双相酶解桃叶珊瑚苷的影响。反应结束后，将反应体系置于冰上，分离有机相和水相，用HPLC测定有机相和水相中桃叶珊瑚苷及苷元浓度，并计算分配系数lgP。

1.4 桃叶珊瑚苷元稳定性分析

1.4.1温度的影响 酶解反应完立刻将酶解液置于-20～90 ℃放置，并于0、 2、 4、 8、 12和24 h取样，HPLC测定桃叶珊瑚苷元残余量，计算苷元保留率。

1.4.2溶液pH值的影响 酶解反应完立刻将酶解液用柠檬酸和磷酸氢二钠调节溶液pH值为3.0～8.0，室温放置，并于0、 2、 4、 8、 12和24 h取样，HPLC测定桃叶珊瑚苷元残余量，计算苷元保留率。

1.4.3抗氧化剂浓度的影响 酶解反应完立刻向酶解液分别加入2、 5、 10和20 g/L的VC水溶液，室温放置，于0、 2、 4、 8、 12和24 h取样，HPLC测定桃叶珊瑚苷元残余量，计算苷元保留率。

1.4.4有机溶剂的影响 取配制好的50 mmol/L桃叶珊瑚苷溶液，与柠檬酸缓冲溶液(pH值4.5)混匀，加入相同体积的正丁醇、正己醇和乙酸乙酯有机溶剂，构成双相体系，分别加入相同量的糖苷酶(25 U/mL)，于35 ℃振荡20 min，离心分离有机相，室温放置，分别于0、 2、 4、 8、 12和24 h取样，进行HPLC分析并计算桃叶珊瑚苷元保留率。

1.5 数据分析

1.5.1HPLC分析 采用高效液相色谱法测定桃叶珊瑚苷及其苷元的量。以桃叶珊瑚苷和苷元为标准品，以水为溶剂配制质量浓度为50、 25、 12.5、 6.25和3.125 mmol/L的标准溶液并建立标准曲线。桃叶珊瑚苷的标准曲线方程为：y=1 772.7x+170.14，R2=0.999 6。桃叶珊瑚苷元的标准曲线方程为：y=2 307.7x-62.036，R2=0.999 8。

HPLC条件：色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；二极管阵列检测器(DAD)，紫外检测波长206 nm；流动相为甲醇/水(体积比10 ∶90)。

1.5.2产率计算 分配系数(lgP)按照式(1)计算，单水相桃叶珊瑚苷转化率(ηau1)按式(2)计算，桃叶珊瑚苷元产率(Yaug1)按式(3)计算，双相桃叶珊瑚苷转化率(ηau2)按式(4)计算，桃叶珊瑚苷元的产率(Yaug2)按式(5)计算。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：Co—桃叶珊瑚苷或苷元在有机相中的浓度，mmol/L；Cw—桃叶珊瑚苷或苷元在水相中的浓度，mmol/L；Vw—水相的体积，L；Vo—有机相的体积，L；Cauw—水相中桃叶珊瑚苷的初始浓度，mmol/L；Cauw1—反应后水相中桃叶珊瑚苷的浓度，mmol/L；Cauo—有机相中桃叶珊瑚苷的初始浓度，mmol/L；Cauo1—反应后有机相中桃叶珊瑚苷的浓度，mmol/L；Caugw—水相中桃叶珊瑚苷元的浓度，mmol/L；Caugo—有机相中桃叶珊瑚苷元的浓度，mmol/L。

2 结果与讨论

2.1 单相酶解条件的优化

2.1.1酶用量 综合考虑酶的最适反应温度、最适反应pH值，设定反应温度为37 ℃，缓冲液pH值为4.5，酶解时间30 min，考察酶用量对桃叶珊瑚苷元产率的影响，结果如图1(a)所示。随着酶用量的增加，苷元的产率也在增加，当酶用量大于10 U/mL时，苷元产率的增加趋于平稳；当酶用量为25 U/mL时，苷元产率达到最大值。因此，为了获得更高产率的桃叶珊瑚苷元，确定适宜酶用量为25 U/mL。

2.1.2酶解时间 设定反应温度为37 ℃，缓冲液pH值为4.5，酶用量25 U/mL，考察酶解时间对桃叶珊瑚苷元产率的影响，结果如图1(b)所示。酶解时间在10 min以内时，桃叶珊瑚苷元产率随着时间的延长而快速增加；10～20 min时，苷元的产率增长缓慢，且在20 min时达到最大值，当酶解时间超过20 min时，苷元产率下降，表示桃叶珊瑚苷元确实存在进一步分解。因此桃叶珊瑚苷适宜酶解时间是20 min。

2.1.3反应温度 设定缓冲液pH值为4.5，酶用量25 U/mL，酶解时间为20 min，考察反应温度对桃叶珊瑚苷元产率的影响，结果如图1(c)所示。当反应温度小于35 ℃时，随着温度升高产物产率也在上升；反应温度大于35 ℃时苷元产率随着温度增高而降低，因采用的β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50 ℃，表明温度大于35 ℃时苷元降解速度大于产物积累速度，因此适宜反应温度选择35 ℃。在此条件下，单水相酶解制备桃叶珊瑚苷元的产率达到最高，为46.3%。

a.酶用量enzyme dosage； b.酶解时间enzymolysis time； c.反应温度reaction temperature

2.2 双相酶解条件的优化

2.2.1有机溶剂的筛选 在水-有机溶剂两相体系中，有机溶剂的种类及体积分数不仅对催化反应有显著的影响，还影响到桃叶珊瑚苷和苷元的溶解性，以及产物分离难易程度。因此实验考察了桃叶珊瑚苷和桃叶珊瑚苷元在不同有机溶剂和水双相中的分配情况，分配效果通过lgP值评价，lgP值越大说明该物质在有机相中的分布比例越高。lgP值是桃叶珊瑚苷和桃叶珊瑚苷元在有机相与水相中浓度的比值再取对数，lgP=0表明水相中分布比例与有机相中相同，lgP>0表明水相中分布比例小于有机相中，lgP<0表明水相分布比例大于有机相分布比例。从表1中可知，产物桃叶珊瑚苷元在多种双相体系中lgP值均小于0，表明其在水相中的分布比例大于其在有机相中的分布比例。其中，桃叶珊瑚苷元在正丁醇中lgP值最高，表明桃叶珊瑚苷元在正丁醇中溶解性最好，最有利于苷元的稳定[9]。从底物桃叶珊瑚苷的lgP值可知，桃叶珊瑚苷在乙酸乙酯中溶解性能最好，由于酶解反应主要在水相中进行，因此乙酸乙酯-水双相体系不利于酶解反应的进行，但桃叶珊瑚苷在正丁醇-水双相体系中具有比较适中的分配比例。所以选用正丁醇开展后续双相酶解制备桃叶珊瑚苷元反应。

表1 桃叶珊瑚苷和桃叶珊瑚苷元在不同有机溶剂的分配情况

2.2.2正丁醇体积分数 双相酶解体系中体积分数为0、 20%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和90%的正丁醇对桃叶珊瑚苷转化率和苷元产率的影响如图2(a)所示。正丁醇体积分数小于80%时，桃叶珊瑚苷元产率随着有机相含量的增加而提高，转化率不断下降。体积分数大于80%时，随着有机相比例增加，产率逐渐下降，推测是有机溶剂抑制了酶的活性。因此选择体积分数80%的正丁醇用于后续双相酶解。

2.2.3反应温度 双相酶解体系中反应温度对桃叶珊瑚苷转化率和苷元产率的影响如图2(b)所示。随着温度的升高，桃叶珊瑚苷的转化率不断提高。相同酶解时间时，桃叶珊瑚苷元在35 ℃产率最高，温度高于35 ℃后桃叶珊瑚苷元的产率开始下降。主要原因可能是生成的苷元的量低于因温度上升降解的苷元的量。因此，选择双相酶解反应温度为35 ℃。

2.2.4酶解时间 双相酶解体系中酶解时间对桃叶珊瑚苷转化率和苷元产率的影响如图2(c)所示。30 min以内，转化率随着时间增加而不断升高；桃叶珊瑚苷在30 min时几乎完全转化，30 min以后随着酶解时间的延长，转化率趋于稳定，60 min时能达到完全转化。0～20 min，桃叶珊瑚苷元产率随着时间增加而提高，在20 min时产率达到最大值。因此，选择双相酶解时间为20 min。在此条件下，双相酶解制备桃叶珊瑚苷元的产率高达87.9%。

a.正丁醇体积分数 volume fraction of n-butanol； b.反应温度reaction temperature； c.酶解时间enzymolysis time

本研究结果表明，采用双相水解工艺更有利于桃叶珊瑚苷元的稳定，同时能有效提高桃叶珊瑚苷元的产率。由于桃叶珊瑚苷是一种环烯醚萜苷类化合物，在水解过程中会生成半缩醛结构的苷元，苷元在水溶液中会发生自身聚合，生成二聚体，并且苷元易与具有蛋白结构的酶发生反应，伴随褐色副产物的生成。副反应一方面钝化了酶的活力[17]，使环烯醚萜苷的水解难以彻底完成，同时消耗了水解产物环烯醚萜苷元，降低了产率。本研究利用水解产物桃叶珊瑚苷元与桃叶珊瑚苷在有机溶剂中溶解性的差异，选用了较为合适的有机溶剂正丁醇，在酶解反应的同时，从反应液中及时萃取分离出酶解生成的苷元，减少酶的钝化和产物的聚合，因而能显著提高苷元的产率。

2.3 桃叶珊瑚苷元稳定性分析

2.3.1温度的影响 在不同温度下测定桃叶珊瑚苷元含量的变化，结果如图3(a)所示。桃叶珊瑚苷元在-20和0 ℃条件下非常稳定，-20 ℃保温12 h内不会降解。37 ℃保温12 h时几乎全部降解，随着温度增高苷元稳定性降低，70 ℃下保温仅4 h苷元就几乎全部降解，表明桃叶珊瑚苷元热稳定性很差。

2.3.2pH值的影响 在不同pH值条件下分析桃叶珊瑚苷元含量，结果如图3(b)所示。桃叶珊瑚苷元在酸性条件下较为稳定，在中性和碱性条件下极易分解，在pH值3.0条件下8 h仅降解12%。

2.3.3抗氧化剂质量浓度的影响 桃叶珊瑚苷元极易发生氧化聚合反应，通过添加抗氧化剂如VC溶液可以一定程度缓解桃叶珊瑚苷元的降解。在不同VC质量浓度下测定桃叶珊瑚苷元含量，结果如图3(c)所示。桃叶珊瑚苷元在抗氧化剂存在条件下相对稳定，VC加入后苷元分解量明显减少，随着加入VC质量浓度的增加，苷元分解持续减少，VC质量浓度高于5 g/L时，苷元分解量不再持续减少，因此最适VC质量浓度为5 g/L，此时桃叶珊瑚苷元2 h内仅降解8%。

2.3.4有机溶剂的影响 苷元在有机溶剂正丁醇、正己醇中溶解性较好，且桃叶珊瑚苷元在低温的乙酸乙酯中比较稳定[9]，因此考察了3种有机溶剂对桃叶珊瑚苷元稳定性的影响，结果如图3(d)所示。以苷元在水相溶液中稳定性作为对照，可以看出桃叶珊瑚苷元在正己醇中稳定性较差，4 h内完全降解；在乙酸乙酯和正丁醇中比较稳定，8 h内几乎不降解。但乙酸乙酯-水体系易发生乳化现象，影响苷元的分离。

a.温度temperature； b.pH值 pH value； c.VC质量浓度 VC mass concn.； d.有机溶剂种类types of organic solvents

显然，有机溶剂对桃叶珊瑚苷元稳定性有较大影响，可能是由于有机溶剂对桃叶珊瑚苷元产生了溶剂化效应[18]。溶剂化效应可以提高异构体的稳定性，极性较大时稳定性显著增强，因此桃叶珊瑚苷元在极性较高的正丁醇中稳定性显著增强。研究结果也表明，在今后制备桃叶珊瑚苷元的整个过程中，要将酶法转化影响因素、分离方法、保藏手段与桃叶珊瑚苷元稳定性影响因素结合起来。

3 结 论

3.1适宜的单水相酶解桃叶珊瑚苷条件为：酶用量25 U/mL、酶解时间20 min、反应温度35 ℃，在此条件下，桃叶珊瑚苷元的产率为46.3%；双相酶解法催化桃叶珊瑚苷生成桃叶珊瑚苷元的适宜条件为：正丁醇体积分数为80%、酶用量25 U/mL、酶解时间20 min、反应温度35 ℃，在此条件下，桃叶珊瑚苷元的产率高达87.9%，是目前有关报道中最高的产率。而且双相酶解法能在反应的同时萃取分离生成的苷元，将其保留在有机相中，减少酶的钝化和产物的聚合。

3.2桃叶珊瑚苷元热稳定性较差，在-20和0 ℃条件下非常稳定；在pH值3.0时较为稳定，8 h内仅降解12%；苷元极易氧化聚合，添加5 g/L的VC可在一定程度缓解桃叶珊瑚苷元的氧化聚合；有机溶剂极性影响着桃叶珊瑚苷元的稳定性，桃叶珊瑚苷元在正丁醇和乙酸乙酯中都比较稳定，但由于乙酸乙酯相与水相极易产生乳化，正丁醇更利于分离、保存桃叶珊瑚苷元。