圆齿野鸦椿果皮多糖的提取及其抗炎活性研究

黄 维， 郭梦云， 王玉启 ， 林金垒， 张宇翔， 邹双全

(1.福建农林大学 生命科学学院,福建 福州 350004; 2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350004)

圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata)为省沽油科落叶灌木或小乔木，是优良的观赏植物[1-2]。同时圆齿野鸦椿果也是福建的民间传统药材，具有行气镇痛、消肿散结的功效，多用于治疗偏头痛、胃痛、肠炎等[3-4]。现代化学和药理学研究发现，圆齿野鸦椿果皮中主要含有三萜、黄酮、色原酮、多酚、多糖等成分[5-7]，药用价值有抗炎、抗癌、抗氧化等[8-11]。多糖是圆齿野鸦椿果皮的主要成分之一，本研究对圆齿野鸦椿果皮多糖提取工艺及其单糖组成进行研究与分析，并对多糖抗炎功效进行检测，可为圆齿野鸦椿多糖资源的开发利用提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata)，2018年10月于福建省邵武市天成岩采集果实，经福建农林大学邹双全研究员鉴定为圆齿野鸦椿。果实晒干后分离出果皮和种子，果皮以中药打粉机粉碎后过筛，取粒径小于0.42 mm的样品备用。

从中国科学院上海细胞库购入RAW264.7巨噬细胞。鼠李糖、半乳糖、核糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖购于上海安谱实验科技股份有限公司(纯度≥98%)；葡萄糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖购于北京坛墨质检科技有限公司(纯度≥98%)；岩藻糖购于成都曼斯特生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、DEAE-52纤维素和内毒素脂多糖(LPS)购于北京索莱宝科技有限公司；地塞米松购于上海生工生物；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素(青链双抗)均购自美国Hyclone公司；前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒购于上海酶联生物公司；NO检测试剂盒购于江苏碧云天公司；色谱级乙腈购于德国默克公司。硫酸、苯酚、氯仿、三氟乙酸、无水乙醇、NaOH、NaCl均为分析纯试剂。

Millipore Synergy-UV超纯水机，美国密理博公司；Agilent 1260高效液相色谱(HPLC)仪，美国安捷伦公司；RE52CS-2旋转蒸发仪；Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪，美国默赛飞公司。

1.2 圆齿野鸦椿果皮多糖的提取

称取经石油醚回流脱脂后的圆齿野鸦椿果皮干粉2.0 g，置于具塞锥形瓶中，以不同的液料比制成混合溶液后，加入超声波容器中，按设定的温度、功率，提取相应的时间，获得不同条件下果皮多糖的提取液。

根据实验条件，选取单因素液料比(10 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1、 25 ∶1、 30 ∶1，mL ∶g)、提取时间(30～120 min)、提取温度(30～70 ℃)、超声波功率(100～500 W)分别进行试验，每一组设置3个重复实验，探讨这4个因素对多糖提取得率的影响。在单因素试验的基础上，设计4因素3水平响应面中心组合实验，使用Design-Expert 10.0.2软件对其结果进行优化。

1.3 圆齿野鸦椿果皮多糖的分离纯化

以优化后的提取方案进行圆齿野鸦椿果皮多糖提取，经过乙醇沉淀后获得圆齿野鸦椿果皮粗多糖。将50 mg 圆齿野鸦椿果皮粗多糖溶解于蒸馏水中，搅拌均匀后上样于DEAE-52纤维素层析柱，用0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L的NaCl溶液依次进行梯度洗脱，每个浓度洗脱液200 mL，控制洗脱液流速为1.0 mL/min，收集洗脱液，每管5 mL。测定洗脱液在490 nm处的吸光度值，绘制洗脱时间与吸光度值的关系曲线，合并单一对称峰的洗脱液，采用旋转蒸发仪浓缩至10 mL左右，用相对分子质量3 000的透析袋在流动的纯水中透析过夜去除NaCl，再进行冷冻干燥，收集得到圆齿野鸦椿果皮多糖的一个主要成分，将其标记为PEP。

1.4 多糖的分析测定

1.4.1多糖中糖、蛋白和糖醛酸质量分数测定 采用苯酚-硫酸法测定果皮多糖中糖的含量，以葡萄糖为对照品绘制标准曲线，测试波长490 nm[12]；采用考马斯亮蓝染色法测定多糖中蛋白质含量，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，测试波长为595 nm[13]；采用硫酸-咔唑法测定多糖中糖醛酸含量，以半乳糖醛酸为标准品，绘制标准曲线，测试波长523 nm[14]。

1.4.2多糖分子质量的测定 称取分子质量1～700 ku的葡聚糖为标准品，采用高效凝胶渗透色谱(GPC)法测定PEP的数均相对分子质量(Mn)、重均相对分子质量(Mw)，Z均相对分子质量(Mz)[15]。色谱条件: Shodex OHpak SB-806HQ色谱柱(300 mm×8.0 mm，5 μm)，流动相为超纯水(0.02%叠氮化钠)，pH值6，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，示差折光检测器，进样量20 μL。

1.4.3单糖组成的测定 精密称取葡萄糖5.0 mg、鼠李糖 4.6 mg、阿拉伯糖5.0 mg、半乳糖醛酸 4.2 mg、半乳糖4.9 mg、岩藻糖4.7 mg、核糖5.2 mg、甘露糖4.6 mg、木糖4.3 mg和葡萄糖醛酸4.8 mg于磨砂具塞试管中，用10%甲醇定容至5 mL，混合均匀后得到标准品溶液。

精密称取冷冻干燥后的PEP 10.0 mg，加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，于100 ℃下水解2 h，冷却后用3 mol/L NaOH中和至pH值为7，然后用蒸馏水定容至5 mL，得到水解后的PEP样品。

取标准品溶液和水解后的样品溶液各200 μL，分别加入0.3 mol/L NaOH溶液200 μL，0.5 mol/L PMP 200 μL，混合均匀后置于70 ℃的水浴加热100 min，冷却后依次加入0.3 mol/L盐酸和蒸馏水各200 μL。混匀后加入1 mL氯仿萃取，之后弃去氯仿层，再重复萃取3次，上清液以0.22 μm滤头过滤后进行HPLC检测[16]。

1.5 多糖的抗炎活性研究

采用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7构建炎症反应细胞模型，考察PEP给药后对细胞存活率和炎症因子分泌量的影响。用DMEM培养基(含1%青链双抗和10%胎牛血清)培养RAW264.7细胞。设置调零孔(仅有培养基，无细胞存在)为对照，以每毫升2×105个RAW264.7细胞接种至96孔板上，每孔180 μL细胞液。培养过夜后，将有细胞的孔划分为模型组、空白对照组、给药组和阳性对照组，每组各5个复孔。空白对照组和模型组给予含0.1%二甲基亚砜(DMSO)的DMEM培养基，阳性对照组以200 mg/L 给予地塞米松，给药组分别以1、 2、 5 和10 g/L PEP给药，每组所加入的体积均为20 μL。除空白对照组外，阳性对照组和给药组以药物作用2 h后，再以LPS(终质量浓度为 1 mg/L)刺激22 h[17]。

取一定量的细胞培养液，用NO试剂盒对RAW264.7细胞上清液NO的分泌情况进行检测，用ELISA试剂盒对RAW264.7细胞上清液中炎症因子PGE2 的表达量进行检测。取RAW264.7细胞于96孔板上，每孔180 μL细胞液，于恒温箱培养24 h后，每孔加入10 μL 5 g/L的MTT溶液，继续培养 4 h 后，弃去上清液，向细胞中加入150 μL DMSO溶液振荡溶解10 min，测定波长490 nm处的吸光度(A)，计算细胞存活率(%)=(A药物-A调零)/(A空白-A调零)×100%，其中，A药物表示经药物处理孔中样品的吸光度值，A调零表示调零孔中样品的吸光度值，A空白表示空白孔中样品的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 多糖提取的单因素试验

为了探究多糖提取的最佳条件，分别采用不同的液料比、超声波功率、提取时间和提取温度来提取圆齿野鸦椿果皮多糖。图1(a)为不同的液料比对提取得率的影响情况，其他提取条件为温度40 ℃、超声波功率300 W、提取60 min，发现液料比达到25 ∶1(mL ∶g)后，液料比继续增加，多糖提取得率趋于稳定甚至略微降低，可能是由于液料比在超过一定比例后，多糖的溶出速度会变慢引起的。图1(b)为不同超声波功率对提取得率的影响，其他提取条件为液料比25 ∶1(mL ∶g)、提取温度40 ℃、提取时间60 min，得出超声波功率达到400 W时，多糖提取得率最大，当超声波功率达到500 W时，提取得率下降，可能是超声波功率过大会引起多糖降解。图1(c)为研究不同提取时间对果皮多糖提取得率的影响，其他提取条件为超声波功率400 W、温度40 ℃、液料比25 ∶1(mL ∶g)，得出提取时间为120 min时，提取得率最高，提取时间超过120 min会导致多糖提取得率下降，可能与提取时间过长引起多糖结构破坏相关。图1(d)研究了提取温度在30～70 ℃间对提取得率的影响，其他提取条件为液料比25 ∶1(mL ∶g)、超声波功率400 W、提取时间为120 min，得出提取温度为60 ℃时，圆齿野鸦椿果皮多糖的提取得率达到最高，提取温度进一步升高提取得率下降，可能与高温会引起多糖降解有关。因此，选取提取液料比25 ∶1(mL ∶g)、超声波功率400 W、提取时间120 min和提取温度60 ℃作为响应面法试验的中心值。

图1 液料比(a)、超声波功率(b)、提取时间(c)和提取温度(d)对圆齿野鸦椿果皮多糖提取得率的影响

2.2 响应面法优化提取工艺

根据单因素试验的结果，采用中心组合原理，将液料比(X1)、超声波功率(X2)、提取时间(X3)、提取温度(X4)设为自变量，多糖提取得率为因变量(Y)，进行响应面法试验设计，试验结果见表1。

表1 响应面分析方案及结果

续表1

表2 回归模型方差分析

通过Design Expert 10.0.2分析，得出多糖提取工艺的最佳条件为液料比28.94 ∶1(mL ∶g)、超声波功率384.76 W、提取时间102.16 min和提取温度62.7 ℃，提取得率高达29.50%。根据实际实验条件调整，最佳提取条件是液料比30 ∶1(mL ∶g)、超声波功率400 W、提取时间100 min和提取温度60 ℃。在进行5次验证实验后，得到多糖提取得率平均值为(29.15±0.26)%，与理论值较为接近，说明此响应面模型可靠。

2.3 圆齿野鸦椿果皮多糖的分离纯化

图2 圆齿野鸦椿果皮多糖的洗脱曲线

将提取的多糖溶液进行醇沉后，用DEAE-52纤维素柱对其进行分离纯化。采用0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L的NaCl溶液依次进行梯度洗脱，每个浓度洗脱液体积200 mL，收集每管洗脱液5 mL，采用苯酚-硫酸比色法于490 nm波长下检测每管洗脱液的吸光值。通过绘制洗脱液的管数与其吸光值的关系曲线，得到一个明显的峰(见图2)。合并此峰相应的洗脱液(40～53管)，先用旋转蒸发仪浓缩后再透析除盐，然后对其冷冻干燥，得到了圆齿野鸦椿果皮多糖的一个主要成分，命名为PEP。采用考马斯亮蓝染色法和苯酚-硫酸法检测PEP中蛋白质和多糖的含量，其中蛋白质为0.02%，多糖为89.26%，糖醛酸为7.38%。采用高效GPC法测定PEP的相对分子质量，结果表明：PEP化学均一性较好，基本呈现单一峰形，重均相对分子质量(Mw)为4 958，数均相对分子质量(Mn)为3 664，Z均相对分子质量(Mz)为5 866，聚合物分散性指数(PDI)为1.353，接近1，说明PEP多糖分子质量分布比较均匀。

2.4 PEP单糖组成分析

1.甘露糖mannose； 2.核糖ribose； 3.鼠李糖rhamnose； 4.葡萄糖醛酸gluconose； 5.半乳糖醛酸galactose aldose； 6.葡萄糖glucose； 7.半乳糖galactose； 8.阿拉伯糖 arabinose； 9.木糖xylose； 10.岩藻糖fucose

PEP经过柱前衍生化，并用HPLC检测其单糖组成情况，结果如图3所示。PEP含有10种单糖，分别为甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、核糖。根据标准品中单糖浓度、样品和标准品单糖峰面积的比值，计算出PEP中含甘露糖5.65%、葡萄糖37.06%、半乳糖19.51%、岩藻糖2.24%、木糖26.10%、 核糖1.33%、 葡萄糖醛酸0.89%、 鼠李糖2.33%、 半乳糖醛酸0.68% 和阿拉伯糖4.20%。分析结果表明：圆齿野鸦椿果皮多糖中的葡萄糖、木糖和半乳糖含量较高。葡萄糖和半乳糖为主要的供能糖类，而木糖为优质的无热量甜味剂，对改善人体肠道微环境亦具有良好的功效[18]。文献报道圆齿野鸦椿果实对痢疾等胃肠疾病有较好的疗效[3-4]，可能与其多糖中的木糖含量较高有关。

2.5 PEP抗炎活性检测

PEP对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子的分泌和细胞存活率的影响如表3所示。

表3 PEP对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应和存活率的影响

当PEP质量浓度为1、 2、 5和10 g/L时，RAW264.7细胞上清液分泌的NO和PGE2含量均显著低于模型组的含量(P<0.05或P<0.01)，且上述两个炎症因子的含量随PEP质量浓度增大而降低，说明PEP能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO和PGE2炎症因子的分泌；MTT法对给药后的细胞进行检测，发现PEP给药浓度在0～10 g/L范围内时，RAW264.7细胞的存活率变化不显著(P>0.05)，表明PEP对RAW264.7细胞无明显细胞毒作用。

3 结 论

3.1采用超声波辅助提取圆齿野鸦椿果皮多糖，通过单因素法和响应面法结合，优化了多糖的提取条件。考察了不同液料比、超声波功率、提取时间和提取温度对多糖提取得率的影响，结果表明：优化后的提取条件为液料比30 ∶1(mL ∶g)、超声波功率400 W、提取时间100 min、提取温度60 ℃，响应面法优化得到的最高理论提取得率为29.50%，该条件下5次验证试验的平均提取得率为(29.15±0.26)%，说明此工艺多糖提取得率高且重复性较好。

3.2采用DEAE-52纤维素柱对醇沉后的多糖进行分离纯化，得到一个主要组分PEP，经高效凝胶渗透色谱测得多糖的分子质量约为5 ku，柱前衍生化HPLC分析结果显示：PEP中含有10种单糖，其中甘露糖5.65%、葡萄糖37.06%、半乳糖19.51%、岩藻糖2.24%、木糖26.10%、核糖1.33%、葡萄糖醛酸0.89%、鼠李糖2.33%、半乳糖醛酸0.68%和阿拉伯糖4.20%。

3.3采用LPS诱导巨噬细胞RAW264.7构建炎症反应细胞模型，考察PEP给药后对细胞存活率和炎症因子分泌量的影响。结果显示：1～10 g/L的PEP能降低LPS诱导的炎症因子NO和PGE2的分泌，并呈现剂量依赖性，且对RAW264.7细胞的存活率无显著影响，体现了圆齿野鸦椿果皮多糖具有高抗炎活性和无细胞毒性的优点，提示圆齿野鸦椿果皮多糖具有良好的开发利用前景。