血小板功能实验预测氯吡格雷用于缺血性卒中二级预防的有效性和安全性分析

程越，邵腾飞，黄丽丽，杨丹，徐运

氯吡格雷等P2Y12受体拮抗剂是临床常用的缺血性卒中治疗和二级预防的抗血小板药物，不过患者在服药后残留的血小板反应性差别较大[1]。研究表明，血小板的高反应性与缺血性卒中患者缺血性事件复发密切相关[2-6]。血小板功能实验对残留血小板反应性的评价有助于临床调整用药以降低血小板反应性。目前，关于最佳定量血小板反应性的方法还在探索中，临床常用的血小板功能检测方法有透射光法血小板聚集实验（light transmittance aggregometry，LTA）、血栓弹力图（thromboelastography，TEG）和血小板功能分析仪法（platelet function analyzer，PFA）[4]。本课题组前期的研究对三种血小板功能实验的表现进行了分析，但由于前期研究未收录预后数据，无法评价不同血小板功能实验对患者预后的预测价值[7]。本研究对患者进行随访并收集预后信息，以评价LTA、TEG和PFA三种血小板功能实验对轻型缺血性卒中预后的预测价值，为卒中的精准二级预防提供更多依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 前瞻性连续入组2017年5月-2019年2月南京大学医学院附属鼓楼医院神经内科诊治的急性轻型缺血性卒中患者。入组标准：①发病7 d内的缺血性卒中[8]；②轻型卒中，NIHSS≤3分；③使用氯吡格雷（75 mg/d）作为抗血小板治疗药物，且随访中服药依从性良好，坚持以氯吡格雷作为二级预防用药。排除标准：①血小板计数＞450×109/L或＜100×109/L；②有已知的血小板功能障碍；③使用已知对血小板功能有影响的协同药物，如肝素、低分子肝素、替格瑞洛、西洛他唑、华法林或其他新型口服抗凝剂等。

本研究经南京大学医学院附属鼓楼医院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 分组和资料收集 收集患者的年龄、性别等一般资料，既往卒中、冠心病、心房颤动、高血压、糖尿病等病史及吸烟史，实验室测定患者的CYP2C19基因型、血小板功能结果。2019年8月通过门诊或电话对所有患者进行随访。随访的主要终点事件为缺血性卒中（不包括TIA）复发。安全性终点为出血事件，定义为经过两名临床医师检查认为同抗血小板药物相关，且排除其他因素所致的消化道、口鼻腔、尿路出血及皮下瘀斑。

根据是否有缺血性卒中复发分为复发组和未复发组；根据是否有出血事件分为出血组和未出血组。采用荧光原位杂交技术进行CYP2C19基因检测，按照结果分别3组：①快代谢组，包括快代谢型和超快代谢型（*1/*1和*1/*17）；②中等代谢型（*1/*2和*1/*3）为中等代谢组；③慢代谢型（*2/*2、*2/*3和*3/*3）为慢代谢组。

1.3 血小板功能检测方法 采集患者服用氯吡格雷5 d后的空腹静脉血，分别采用LTA、TEG和PFA三种血小板功能实验评价患者的血小板反应性。

LTA的原理是在富集血小板的血浆中，血小板在诱导剂刺激下发生活化聚集，聚集物形成降低了悬浮液的浊度，以致透光性增加。以20 μmol/L的ADP作为诱导剂，检测氯吡格雷抗血小板聚集的效果。血小板反应性，即聚集程度的评价指标表示为聚集率（范围是0～100%），血小板高反应性的界值为60%，即＞60%表示对氯吡格雷呈现抵抗作用，血小板功能呈高反应性。

TEG是采用抗凝的全血直接进行血小板聚集功能检测。在体外模拟血栓的形成，加入诱导剂激活后，血液凝固为血栓，感受器测定血栓扭力并传递给电脑生成凝血速度和强度曲线。ADP作为诱导剂激活血小板，测定的凝血速度曲线和强度曲线反映氯吡格雷抗血小板聚集的效果。ADP作为诱导剂反应氯吡格雷抗血小板聚集的效果。血小板功能以血小板抑制率（范围是0～100%）表示，＜50%说明对氯吡格雷呈现低反应性，血小板功能呈高反应性。

PFA使用西门子INNOVANCE PFA-200血小板功能分析仪检测，其原理是在血流条件下，模拟血栓形成，测定血栓封闭孔隙的时间（闭合时间）反映血小板聚集率。使用P2Y试剂盒（孔隙薄膜表面涂有ADP、前列腺素和Ca2+）诱导氯吡格雷服药后血小板活性，闭合时间范围为0～300 s，低于141 s说明对氯吡格雷呈现低反应性，血小板功能呈高反应性。

2 结果

2.1 研究对象的基线和随访信息 研究共纳入76例符合入排标准的患者，年龄39～89岁，平均66.95±11.26岁；男性50例（65.79%）；中位随访时间为13个月。至观察终点时，5例（6.58%）患者缺血性卒中复发；17例（22.37%）患者有出血事件，包括消化道出血4例、口鼻出血3例、尿路出血6例及皮下瘀斑4例；无死亡病例。

2.2 终点事件相关因素分析 对于主要终点事件，缺血性卒中复发组LTA和TEG实验检测的血小板聚集率高于未复发组，血小板抑制率低于未复发组，差异有统计学意义；PFA检测的残留血小板反应性在两组之间的差异无统计学意义。复发组和未复发组间CYP2C19基因型的分布差异无统计学意义。另外，基线资料中，复发组的年龄高于未复发组，差异有统计学意义，其他数据差异无统计学意义（表1）。

表1 卒中复发组与未复发组数据比较

对于安全性终点，出血组和未出血组CYP2C19基因型和三种血小板功能实验测定结果的差异均无统计学意义，出血组和未出血组的基线资料差异也无统计学意义（表2）。

表2 出血组与未出血组数据比较

2.3CYP2C19基因型与不同血小板功能实验结果的关系 快、中等和慢代谢组三组间LTA和PFA所检测到的血小板反应性差异有统计学意义，其中LTA的结果在快代谢组中最低，慢代谢组最高；PFA结果在快代谢组中最高，慢代谢组最低。TEG检测结果在快、中等、慢代谢组中差异无统计学意义（表3）。

表3 不同CYP2C19基因型与血小板反应性

2.4 不同血小板功能实验预测缺血性卒中复发的价值 ROC分析发现，LTA和TEG能够识别缺血性卒中复发的曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.88（95%CI0.73～1.00）和0.79（95%CI0.61～0.97），对缺血性卒中复发有较好的预测价值（图1）。LTA和TEG预测缺血性卒中复发的最佳截断值分别为75.00%和64.60%，灵敏度和特异度分别为80.00%、87.30%和100%、56.30%。PFA预测缺血性卒中复发的AUC为0.74（95%CI0.44～1.00），包含0.5（表4）。

表4 预测复发的ROC曲线

图1 三种血小板功能实验预测缺血性卒中复发的ROC曲线

3 讨论

基于76例规范使用氯吡格雷二级预防的急性轻型缺血性卒中患者的数据，本研究结果表明LTA和TEG对缺血性卒中复发有较好预测能力，而PFA所检测的血小板反应性以及CYP2C19基因型与缺血性卒中复发结局无关。CYP2C19基因型与LTA和PFA测得的血小板反应性有关，与TEG所检测的血小板反应性无关。对于服用氯吡格雷可能会出血的安全性问题，三种血小板功能检测结果以及CYP2C19基因型均与抗血小板药物相关出血事件的发生无统计学关联，无法提供可靠的参考。

有关血小板功能检测对缺血性卒中二级预防用药的指导价值一直是临床研究的热点。血管成形术治疗中使用抗血小板药物降低心肌损伤-血小板反应性预测结局（Antiplatelet therapy for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty-Platelet Reactivity Predicts Outcome，ARMYDA-PRO）研究及血小板功能实验预测提前使用氯吡格雷抗血小板治疗的经皮冠状动脉介入治疗患者的临床结局（Do Pointof-care Platelet Function Assays Predict Clinical Outcomes in Clopidogrel Pretreated Patients Undergoing Elective PCI，POPular）研究结果均表明血小板功能呈现高反应性与缺血性事件的临床复发相关[9-10]。2020年一项关于中国汉族人群急性缺血性卒中服用氯吡格雷用于二级预防的前瞻性研究发现，LTA实验所检测到的残留血小板高反应性会增加缺血性事件复发风险，而CYP2C19功能缺失性等位基因携带者（*2、*3）与卒中复发无关[11]。Yi等[12]通过375例缺血性卒中患者的队列研究发现，经LTA检测血小板高反应性是复发性缺血事件（缺血性卒中、心肌梗死）的独立危险因素。目前进一步利用缺血性事件复发或者出血事件发生的预后数据评价血小板功能实验的灵敏度和特异度的研究较少，因此仍需进一步积累证据以供临床参考。

本研究增加了LTA对缺血性卒中复发具有良好临床预测价值的证据，与目前所认为的LTA是评估血小板功能的金标准的观点一致[13]。氯吡格雷治疗急性非致残性脑血管事件高危人群研究（Clopidogrel in High-risk Patients with Acute Non-disabling Cerebrovascular Events，CHANCE）的子研究（265例）显示TEG检测的最大振幅越大，缺血性事件（包括缺血性卒中、TIA、心肌梗死）的复发风险越高，最大振幅≥48 mm可以预测缺血性事件的复发，这有助于轻型卒中和高危型TIA患者的临床用药决策[14]。首都医科大学附属北京天坛医院对286例非心源性缺血性卒中患者随访一年的研究显示TEG所检测的血小板抑制率对缺血性事件的预测能力较好，AUC达到0.800，这与本研究结果相近[15]。上海长海医院关于急性缺血性卒中患者CYP2C19基因型和血小板功能以及一年预后情况的分析与本研究结果相似，基因型与氯吡格雷抵抗有显著的关联，但是与一年卒中复发事件的联系未达统计学意义[16]。虽然本研究结果说明TEG具有一定的预测价值，但最佳截断值的特异度只有56.30%，可能会造成假阳性结果。

PFA-200实验对既往的PFA-100法在用户操作界面和电子智能化方面进行了改进，目前关于PFA-200应用于缺血性卒中患者的研究报道较少[17]。Breet团队[18]使用PFA-100检测冠状动脉支架置入患者的血小板反应性，未发现其与临床结局（包括全因死亡、急性心肌梗死、支架内血栓和缺血性卒中）有关，ROC曲线也显示其对缺血性事件复发无预测价值。目前有关于急性冠脉综合征患者服用氯吡格雷作为二级预防的研究发现，PFA-200检测结果可以作为随访过程中主要不良心脏事件发生的标志物[19]。本研究暂未发现PFA-200在应用氯吡格雷作为卒中二级预防的人群中预测缺血性卒中复发的价值。

有关出血事件结局，Breet团队[18]的研究未发现LTA、PFA具有识别缺血性卒中患者出血风险的能力。针对经皮冠状动脉介入治疗的患者药物洗脱支架置入后传统抗血小板治疗和血小板功能实验监控指导下调整治疗随机对照研究（Assessment by a Double Randomization of a Conventional Antiplatelet Strategy Versus a Monitoring-Guided Strategy for Drug-Eluting Stent Implantation and of Treatment Interruption Versus Continuation One Year After Stenting，ARCTIC）采用其他的血小板检测实验（VerifyNow抗血小板治疗监测系统）评估血小板反应性，血小板高反应性组出血事件发生风险与低反应性组间无显著差异[20]。本研究数据也显示血小板功能实验测得的结果与一年的抗血小板药物相关出血事件的发生无统计学关联。关于对缺血性卒中患者服用抗血小板药物二级预防阶段出血事件的预测指标仍需进一步探索。

本研究存在一些不足之处，如样本量较小，可能存在统计把握度不足的问题，且所有样本来自一个中心，可能存在病例选择偏倚；另外，当前血小板功能实验的诱导剂及其浓度标准未统一，因此本研究的结果不一定适用于所有的临床中心。因此需要进一步统一检测标准的多中心研究验证本研究的结果。

【点睛】本研究通过LTA、TEG和PFA三种血小板功能实验检测轻型缺血性卒中且规律服用氯 格雷的患者在服药5 d后的血小板反应性，并随访缺血性卒中复发的情况，结果显示LTA和TEG检测结果对缺血性卒中复发有较好的预测价值。