抗血管生成药物阿帕替尼改善肿瘤免疫微环境的研究进展

高纯一，胡天惠

（厦门大学医学院，福建 厦门 361102）

1 阿帕替尼简介

阿帕替尼是江苏恒瑞医药股份有限公司研发的小分子抗血管生成靶向药物，于2014年上市用于胃癌的治疗。此外，该药物在治疗其他多种实体肿瘤中也显示出巨大潜力［1-2］。阿帕替尼主要作用机制是竞争性结合血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）胞内酪氨酸ATP 结合位点，高度选择性地抑制酪氨酸激酶活性，阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factors，VEGF）结合后的信号传导，从而强效抑制肿瘤血管生成。VEGFR-2是VEGF的高亲和力受体，与VEGFR-1 以及VEGFR-3 一起形成受体酪氨酸激酶（RTK）的Flt 亚家族。VEGFR-1以比VEGFR-2 更高的亲和力与VEGF 结合，但是VEGFR-1 对VEGF 的酪氨酸磷酸化作用较弱。因此，VEGFR-2 是主要的RTK，可在内皮细胞中介导VEGF 信号传导并驱动VEGF 介导的血管生成［3］。且VEGFR-2是内皮细胞增殖、发育、迁移、血管形成和出芽的主要调节因子［4］。因此，阿帕替尼比其他抗血管生成剂（如雷莫昔单抗、贝伐单抗和舒尼替尼）可能具有更好的治疗潜力［5］。此外，阿帕替尼可使耐药性肿瘤细胞对化疗药物敏感，并可逆转由ATP 结合盒转运蛋白（ABC）蛋白引起的多药耐药性（MDR）［6］。它也可以通过刺激肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖和增强常规化疗药物药效来发挥抗癌作用。

近年来，阿帕替尼在其他肿瘤中的临床应用以及相关作用机制也得到了较为广泛的关注和探索［7-9］。然而，迄今为止，临床应用普遍停留在抑制异常血管网生成作用上。本综述总结了阿帕替尼的独特作用机制。基于临床前和临床发现重新探究了与阿帕替尼相互作用的途径背后的分子机制。具体来说，阿帕替尼既包括众所周知的抗血管生成作用，又包括新颖的免疫调节机制。这可以促进临床对分子生物学和免疫学的了解，并有助于扩大阿帕替尼治疗的范围和前景。

2 免疫治疗与VEGF/VEGFR 靶点

免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）能够突破肿瘤免疫抑制的瓶颈，恢复肿瘤患者体内被抑制的免疫活性，促使免疫细胞识别并杀死肿瘤细胞，为免疫治疗提供了新思路［10-11］。近年来以程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death 1，PD-1）抗体、程序性细胞死亡蛋白配体1（Programmed cell death ligand 1，PD-L1）抗体和细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（Cytotoxic T lymphocyteassociated protein 4，CTLA-4）抗体等为代表的免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要手段［12］。尤其针对PD-1/PD-L1 的抗体在肺癌、肾癌和黑色素瘤等恶性肿瘤的治疗中已获得较为显著的临床疗效。PD-L1高表达可能是癌症预后不良的分子标志物，也是临床采用抗PD-1/PD-L1治疗的依据。

然而，抗PD-1/PD-L1 治疗也有其自身局限性，主要问题是受益人群比例较低，单药使用反应率一般在10%～40% 之间，且不是所有肿瘤类型均有效［13］，造成获益比例低的主要原因是免疫治疗的疗效极大的依赖于肿瘤微环境（Tumor MicroEnvironment，TME）。TME 主要由脉管系统、细胞外基质、肿瘤周围的其他非恶性细胞以及维持微环境内部联系的复杂信号分子网络等共同组成。这些成分不仅能够促进肿瘤细胞的生长和繁殖，还可以诱导其侵袭与转移［14］。机体的抗肿瘤免疫效应主要是由T 淋巴细胞（CD8+细胞毒性T 细胞和CD4+辅助T细胞）介导的适应性免疫应答［15］。但是TME 的存在和肿瘤自身的低免疫源性会导致肿瘤患者体内CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助T细胞存在活化障碍，这两种细胞的功能在肿瘤微环境中被强烈抑制，是抗PD-1/PD-L1 免疫治疗的主要障碍之一［16］，也是造成免疫治疗响应率低的主要原因之一。因此，抑制肿瘤微环境中负调控免疫细胞的募集，或抑制抑炎因子的分泌，可能使肿瘤免疫治疗效果更显著。近年来，越来越多的研究与临床试验发现抗肿瘤血管生成药物与PD-1/PD-L1 抗体的联合用药能有效提升免疫治疗疗效，其机制与肿瘤微环境的重塑密切相关［17-18］。接下来我们将详述临床前以及临床试验中抗血管生成剂阿帕替尼对免疫细胞抗肿瘤功能的影响（图1）。

图1 阿帕替尼对肿瘤微环境中免疫细胞群的影响

3 阿帕替尼对免疫微环境的影响

3.1 阿帕替尼对效应T细胞的影响在T 细胞方面，这些不寻常的肿瘤血管网为肿瘤细胞提供了攻击屏障。异常血管网中多是未成熟新生血管，不具备正常血管的组织结构，因此不能实行正常功能。新生血管内皮细胞连接疏松，缺乏周细胞和基底细胞的支撑，因此组织液从异常血管网中渗出到肿瘤微环境中进一步压迫血管，血液无法运输氧气和营养物质到肿瘤内部继而造成肿瘤内部的缺氧坏死。同样的，大部分杀伤性T细胞不能够浸润到肿瘤中，其杀伤作用被抑制。而少部分跨越血管内皮细胞跻身于肿瘤微环境的T细胞，在长时间缺氧条件下，由于肿瘤细胞表面免疫抑制标记物PD-L1的表达增加，亦无法杀死肿瘤细胞。因此，只有抗血管治疗后有杀伤活性T 细胞浸润到肿瘤区域，抗PD-1 治疗才能发挥好的疗效［19］。

VEGF增加微环境中调节性T细胞的浸润，并促CD8+T 细胞衰竭。TOX 是T 细胞发育转录因子，在T 细胞的成熟中起重要作用。在肿瘤微环境里，VEGF 上调CD8+T 细胞中TOX 的表达，激活T 细胞的衰竭相关信号通路。抗VEGF 治疗可逆转这一现象。VEGFR-2 靶点药物（Ramucirumab）促进胃癌患者外周血中CD8+T 细胞的比例增加［20］。进一步研究发现VEGFR-2 阻断CD8+T 细胞自身HIF1-α 通路的激活导致其抗炎因子分泌增加［21］。在小鼠肺癌模型中，小剂量阿帕替尼的使用增加肿瘤中CD8+T细胞的浸润［22］。综合多项研究表明，VEGFR-2 的阻断增加CD8+T细胞的比例和活性［23-24］。并且低剂量的VEGFR-2 靶点药物（DC101）更有利于促进CD4+、CD8+T 细胞的肿瘤浸润［25］。在自发性乳腺癌小鼠中，DC101通过增加CD8+T细胞的浸润比例抑制肿瘤的生长［25-26］。在其机制的探索中ELIZABETH ALLEN等［19］提出，在乳腺癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤小鼠模型中，抗VEGFR-2 和抗PD-L1 抗体的组合治疗诱导肿瘤微环境中内皮微静脉的生长增殖。内皮微静脉通过激活淋巴细胞表面的淋巴毒素β 受体（LTβR）促进淋巴细胞的浸润和活性。直接使用LTβR激动剂可增强细胞毒性T 细胞（CTL）活性，从而使PD-L1 抗体在联合抗VEGFR-2 治疗后进一步提升其抗肿瘤疗效。

3.2 阿帕替尼对调节性T细胞的影响调节性T细胞，即CD4+CD25+Treg，占总T 细胞的5%～10%，是肿瘤免疫微环境中关键的负调控细胞。经典亚型分为从胸腺中分化出来的天然调节性T 细胞（nTregs）和被抗原或其他细胞因子诱导分化的诱导性调节性T细胞（iTregs）。Foxp3是Treg的功能活性指标［27］，SUZUKI H等［28］发现，FOXP3+CD4+T细胞上特异性表达VEGFR-2，且VEGFR-2+CD4+T 细胞抑制VEGFR-2-CD4+T 细胞的增殖。肿瘤细胞分泌的TGF-β 通过促进VEGF-A 分泌进一步增加VEGFR2+Tregs 的数量［28］。靶向VEGFR 可以有效降低Treg 的比例，减弱其免疫抑制活性，增强效应T细胞抗肿瘤免疫反应。VEGF-A 直接促进Treg 的增殖，阻断VEGF-A/VEGFR-2通路可以逆转这一现象［29］。

TADA Y 等［20］在胃癌患者靶向VEGFR-2治疗研究中发现后外周血中PD-L1+CD8+T 细胞浸润增加。Treg 比例减少。在治疗中低表达VEGFR-2+Treg 的患者无进展生存期相较于高表达患者更长。更有研究称［30］，小鼠结肠癌研究中，PD-1抗体增加肿瘤组织中FoxP3+Treg的比例，该现象可通过联用VEFR-2抗体恢复，且联用增加肿瘤匀浆中IFN-γ 和TNF-α水平。肝癌小鼠中，VEGF-2 抗体（DC101）增加肿瘤组织中CTL/Treg比例［31］。

3.3 阿帕替尼对巨噬细胞的影响肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophages，TAM）是实体瘤中主要的炎性细胞群，对TME 的构成有重要影响。可塑性是TAM研究中的一个重要概念，即TAM能够根据TME 的不同刺激分化为M1/M2 型。M1 巨噬细胞源自干扰素γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）刺激并分泌的炎性细胞因子。M2 型巨噬细胞由IL-4 和IL-13刺激激活并释放的基质重塑细胞因子。“重塑”TAM，也就是将M2 向抗肿瘤的M1 型转化，可能会成为癌症治疗的潜在有效策略［32］。

肺癌小鼠治疗中，口服低剂量阿帕替尼可增加总巨噬细胞的浸润比例，并使促癌型CD163+M2 巨噬细胞比例降低［22］。肝癌小鼠中，小剂量VEGFR-2抗体（DC101）治疗显著增加肿瘤中浸润的F4/80+CD80+和CD86+M1 巨噬细胞数量，在联合抗PD-1 治疗后降低了F4/80+CD206+M2巨噬细胞的数量［31］。

3.4 阿帕替尼对树突状细胞的影响抗原呈现是抗肿瘤免疫应答的先决条件。未成熟的树突状细胞（Dendritic cell，DCs）缺乏有效的抗原呈现功能，导致机体出现免疫耐受［33］。多篇研究报道VEGF 通过激活NF-κB 抑制体内外DCs 的成熟。ALFARO C等［34］认为，在缺氧环境下肾癌细胞抑制DCs 的成熟分化，该抑制作用可被VEGFR-2的酪氨酸激酶抑制剂Sunitinib 所逆转。在VEGF/VEGFR 对DCs 的功能阻断位点上，目前的说法不一。 有研究称VEGFR-1是DCs成熟主要受体，而VEGFR-2的信号传导对于早期DCs 在血液中分化至关重要，但仅对最终DCs 的成熟产生略微影响［35］。另一研究表明，VEGF抑制成熟DCs将抗原提呈给T细胞的能力，且这种VEGF诱导的DCs功能障碍主要由VEGFR-2介导，通过抗VEGFR-2阻断mAb可以逆转DCs功能障碍［36］。在其机制的探索中，MARTI LC 等［37］判断，VEGF通过VEGF/VEGFR途径上调DCs的IDO表达，IDO进而抑制淋巴细胞的增殖。

3.5 阿帕替尼对骨髓来源抑制性细胞的影响骨髓来源抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）被普遍认为是CD45+CD11b+CD33+CD14-的免疫抑制细胞群，在肿瘤、脾脏、血液、骨髓和肝脏中都有发现MDSCs 的踪影［38］。在TME 中，MDSCs减弱效应T细胞的抗肿瘤功能，同时作用于NK细胞使其细胞因子减少并抑制其细胞毒性［39］。MDSCs表面存在VEGFR-1与VEGFR-2的双重表达，VEGFR-2介导的信号通路促进MDSCs 的增殖［40］。 VEGF/VEGFR-2信号转导也直接促进了MDSC的分化和迁移，招募MDSCs到肿瘤部位并抑制T细胞功能［26］。

4 阿帕替尼联用PD-1/PD-L1疗法的临床应用

4.1 非小细胞肺癌（Non-small-cell Lung Cancer，NSCLC）阿帕替尼在非小细胞肺癌中的Ⅱ/ⅠB期临床试验中表现出显著的生存获益，在与抗PD-1联用后效益更佳。一项Ⅱ期临床试验显示，NSCLC 患者分组接受500～750 mg的阿帕替尼治疗。38名可用于评估的NSCLC 患者中，客观缓解率（Objective response rate，ORR）为13.2%，疾病控制率（Disease control rate，DCR）为63.2%；中位无进展生存期（Progression free survival，PFS）为3.06个月；总生存期（Overall survival，OS）为7.69个月。表明阿帕替尼在晚期NSCLC 患者中有一定作用且仅对患者产生轻微不良反应［41］。另一项NSCLC的ⅠB期临床试验结果表明，在可供分析的8 名NSCLC 患者中联用阿帕替尼的ORR 为55.6%，DCR 为88.9%，在相同的临床环境中优于抗PD-1单一疗法［22］。

4.2 小细胞肺癌（Small-cell Lung Cancer，SCLC）阿帕替尼在SCLC 患者中同样显示出治疗效益。Camrelizumab 200 mg 联合阿帕替尼375 mg治疗，47 名可用于评估的SCLC 患者中，ORR 达到34.0%，中位PFS 为3.6个月，OS 为8.4个月。在SCLC 患者中以结果为导向将患者分为铂类化疗敏感与不敏感群，其中铂类化疗敏感的SCLC 患者的ORR 为37.50%，中位PFS 为3.6个月，OS 为9.6个月，与铂类化疗不敏感组（32.3%，2.7个月，8个月）无显著性差别。本研究表明，在化疗敏感和对化疗耐药的SCLC 患者中，Camrelizumab 联用阿帕替尼均显示出潜在的抗肿瘤活性。

4.3肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）JIANMING XU 等［7］在一项同时针对晚期HCC 和GC/EGJC 患者的研究中对阿帕替尼联合SHR-1210（抗PD-1 抗体）治疗的疗效作出评估，其中试验结束后16 名可用于评估的HCC 患者中有8名获得了部分缓解，部分缓解率（partial response，PR）为50.0%。加上GC/EGJC 患者在内，共39 名可评估患者的ORR 为30.8%。此项研究表明阿帕替尼作为联合疗法的最大耐受剂量为250 mg，晚期HCC患者在联合用药中可获得实际的临床效益。

另一项研究将HCC 患者进行分类。其中70 名患者未接受过一期治疗，120 名患者一期治疗无效，所有患者的用药方案均为联用Camrelizumab（抗PD-1 抗体）200 mg 以及阿帕替尼250 mg·d-1。针对未接受一期治疗的HCC 组，ORR 为34.3%，中位PFS为5.7 months，年存活率为74.7%。针对一期治疗无效的HCC患者的试验表明，可用于评估的120名HCC 患者，ORR 为22.5%，中位PFS 为5.5 months，年存活率为68.2%。此项研究表明Camrelizumab联合阿帕替尼对晚期肝癌患者有生存获益［42］。

4.4食管胃癌（Gastric or esophagogastric junction cancer，GC/EGJC）另一项在GC/EGJC患者的Ⅲ期临床试验中［43］，研究者招募了267 名患者。与安慰剂组相比，阿帕替尼用药组中位OS显著延长（6.5 months vs.4.7 months，P＜0.05），中位PFS亦延长（2.6 months vs.1.8 months，P＜0.001）。

4.5 三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）阿帕替尼在TNBC 患者的Ⅱ期研究中，30名可评估的患者，250 mg 阿帕替尼联和SHR-1210 200 mg 连续给药。结果显示患者ORR为43.3%，DCR 为63.3%，PFS 为3.7个月。部分缓解患者的中位PFS 为7.69个月，显著高于临床无法评估的TNBC 患者（2个月）。SHR-1210 联合阿帕替尼对晚期TNBC患者显示出良好的治疗效果［44］。

5 结 论

在生理情况下，人类正常分化成熟组织中VEGF 及VEGFR 的表达水平很低，只有血管内皮细胞的VEGF 表达水平较高。但临床研究表明，在多数恶性肿瘤中均检测到了VEGF 及VEGFR 的高表达，并与患者癌症高转移风险相关［45］。这是由于肿瘤的生长发展依赖于肿瘤血管提供的氧气和营养物质。而在高代谢的肿瘤中，其生长往往超过现有血管的供应，导致肿瘤内部缺氧的发生［46］。低氧的状态下，调控血管生成的低氧诱导因子（HIF-1）被激活，内皮细胞和肿瘤细胞共同介导上调TME 中的VEGF 表达［47］。VEGF 可以通过刺激内皮细胞产生前列腺素E2（PGE2），间接促进对T 淋巴细胞和MDSCs 的抑制作用［48］，并且通过诱导调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）增殖和分化［49］、抑制树突状细胞（dendritic cells，DCs）前体细胞成熟［50］等机制导致肿瘤微环境形成免疫抑制。

血管生成抑制剂阿帕替尼的出现不仅可以抑制血管生成异常化，更有助于肿瘤免疫微环境的改善。根据临床统计，目前针对阿帕替尼的临床研究高达33 项，其中29 项在中国开展。综合临床试验结果，阿帕替尼与PD-1/PD-L1 抗体的联合用药有效提升免疫治疗疗效，并显著提升患者的生存获益。阿帕替尼作为一种新型的抗肿瘤药物有其优越的发展前景和潜力，在本文中我们总结了阿帕替尼对肿瘤微环境中各类免疫细胞的作用，并归纳了已开展临床试验中阿帕替尼联用PD-1/PD-L1 抗体在不同种类癌症中的有益作用。