甲磺酸阿帕替尼对结肠癌HCT-116细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

杨家敏 李惊雷

结肠癌是世界上第三大常见癌症，癌预后一般较差，5年总体生存率低于5%，这种低生存率主要是由于诊断较晚以及缺乏有效的非手术治疗方法[1]。寻找更好的药物治疗这种致命的肿瘤是迫切需要的。癌细胞对化疗药物反应的一个关键因素是细胞凋亡通路的激活，而这种通路在抗化疗的癌细胞中经常受损[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路紧密调控细胞存活与凋亡的平衡，Akt是PI3K的下游效应因子，引起肿瘤细胞存活/抑制凋亡，在不同凋亡信号的刺激下通过磷酸化诱导下游靶点刺激血管生成[3,4]。因此，Akt信号正成为癌症化疗和治疗的一个有希望的靶点。阿帕替尼是一种新型的血管内皮生长因子2(VEGFR2)酪氨酸激酶高选择性抑制剂，可以显著抑制肿瘤组织中新生血管的生产，其结合亲和力是索拉非尼的10倍以上[5]。通过Ⅲ期临床试验证明，阿帕替尼是惟一有效的晚期胃癌患者治疗药物，且没有化疗适应证[6]。同时，在多个Ⅱ期临床试验结果显示，阿帕替尼中对多种肿瘤显示出了很好的治疗效果[7]。但我们对该药物分子机制的了解仍然有限，尚不清楚阿帕替尼是否对肠癌有抗肿瘤作用。因此，本研究探讨甲磺酸阿帕替尼通过PI3K/Akt信号通路对HCT-116细胞增殖/凋亡的影响，探讨甲磺酸阿帕替尼对肠癌的作用机制，为临床应用甲磺酸阿帕替尼治疗肠癌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 结肠癌HCT-116细胞(中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库，中国)；甲磺酸阿帕替尼片(江苏恒瑞医药股份有限公司，中国)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；RPMI-1640培养基(Hyclone公司，美国)；0.25%胰蛋白酶(天津百赛思试剂公司，中国)；青链霉素溶液和胰酶(Corning公司，美国)；四噻唑蓝(MTT)(Amresco公司，美国)；细胞凋亡检测AnnexinV/PI试剂盒(BD公司，美国)；蛋白抽提试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；鼠抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3单克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)；鼠抗GADPH单克隆抗体和辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)；聚偏乙稀二氟膜(PVDF膜)(Millipore公司，美国)；ECL化学发光液(江苏碧云天生物技术研究所，中国)；高速低温离心机(Sigma，美国)；二氧化碳细胞培养箱(Ther-mo Revco，美国)；倒置显微镜(Nikon公司，日本)；HBS-1096B酶标仪(南京德铁实验设备有限公司，中国)；实时荧光定量PCR仪和流式细胞仪(BD公司，美国)；凝胶成像仪(UVP公司，美国)；BIO-RAD垂直电泳仪(BIO-RAD公司，美国)。

1.2 细胞培养及实验分组 用含胎牛血清(10%)和青链霉素(100 U/L)的RPMI-1640培养液在在37℃、5% CO2、饱和湿度的条件下培养HCT-116细胞，隔天换液，当细胞融合率达到80%左右时进行实验。实验分为空白对照组、阿帕替尼低剂量组、阿帕替尼中剂量组、阿帕替尼高剂量组。空白对照组和阿帕替尼低、中、高剂量组分别给予终浓度为0、1、2、4 μmol/L的甲磺酸阿帕替尼，继续培养48 h后进行相关检测。

1.3 MTT法检测细胞增殖率 按照1.2方法处理细胞，消化后以5×103孔接种于96孔板中，200 μl/孔，待细胞融合后加入MTT 50 μl/孔，继续培养4 h，离心弃上清，加入DMSO 200 μl/孔，振荡，检定吸光度值(OD值)，计算细胞增殖率[细胞增殖率=(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.4 细胞凋亡检测 按照1.2方法处理细胞，消化后转移至离心管内，离心弃上清，用1×Binding buffer调整细胞浓度为1×106/ml，根据细胞凋亡检测AnnexinV/PI试剂盒说明书步骤用流失细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 Western Blot法检测 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达水平按照1.2方法处理细胞，消化后转移至离心管内，离心弃上清，根据细胞量加入胞蛋白抽提试液，裂解2 h；离心取上清，进行蛋白定量；调整蛋白浓度，加入1/5体积的5×Buffer，沸水进行变性，-80℃保存备用。进行电泳、转膜、孵育一抗、孵育二抗，采集图像，对免疫印迹条带灰度值并进行分析。

2 结果

2.1 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞增殖的影响 与空白对照组比较，给予甲磺酸阿帕替尼处理后，HCT-116细胞增殖率降低，且随着甲磺酸阿帕替尼剂量增加，细胞增殖率降低越显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

组别细胞增殖率(%)空白对照组100.00±4.61阿帕替尼低剂量组92.45±8.24∗阿帕替尼中剂量组81.03±4.96∗#阿帕替尼高剂量组53.00±5.92∗#△

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阿帕替尼低剂量组比较，#P<0.05；与阿帕替尼中剂量组比较，△P<0.05

空白对照组

阿帕替尼低剂量组

阿帕替尼中剂量组

阿帕替尼高剂量组

图1 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞增殖的影响

2.2 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达的影响 与空白对照组比较，给予甲磺酸阿帕替尼处理后，HCT-116细胞PI3K和Akt表达变化不显著，差异无统计学意义(P>0.05)；p-PI3K和p-Akt表达降低，且随着甲磺酸阿帕替尼剂量增加，降低越显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2，图2。

组别PI3Kp-PI3KAktp-Akt空白对照组0.81±0.081.10±0.040.70±0.101.32±0.17阿帕替尼低剂量组0.88±0.140.94±0.13∗0.64±0.081.06±0.09∗阿帕替尼中剂量组0.85±0.150.76±0.05∗#0.74±0.180.87±0.16∗#阿帕替尼高剂量组0.91±0.080.31±0.02∗#△0.78±0.240.39±0.05∗#△

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阿帕替尼低剂量组比较，#P<0.05；与阿帕替尼中剂量组比较，△P<0.05

空白对照组阿帕替尼低剂量组阿帕替尼中剂量组阿帕替尼高剂量组

图2 甲磺酸阿帕替尼对人结肠癌HCT-116细胞凋亡的影响

2.3 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞凋亡的影响 与空白对照组比较，给予甲磺酸阿帕替尼处理后，HCT-116细胞凋亡率增加，且随着甲磺酸阿帕替尼剂量增加，细胞凋亡率增加越显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图3。

组别细胞凋亡率(%)空白对照组0.54±0.03阿帕替尼低剂量组8.16±0.51∗阿帕替尼中剂量组10.37±1.53∗#阿帕替尼高剂量组15.07±2.46∗#△

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阿帕替尼低剂量组比较，#P<0.05；与阿帕替尼中剂量组比较，△P<0.05

图3 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达的影响；A:空白对照组，B:阿帕替尼低剂量组，C:阿帕替尼中剂量组，D:阿帕替尼高剂量组

2.4 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响 与空白对照组比较，给予甲磺酸阿帕替尼处理后，HCT-116细胞Bcl-2表达降低、Bax和Caspase-3表达增加，且随着甲磺酸阿帕替尼剂量增加，Bcl-2表达降低越显著、Bax和Caspase-3表达增加越显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4，图4。

组别Bcl-2BaxCaspase-3空白对照组1.51±0.140.13±0.020.20±0.05阿帕替尼低剂量组0.94±0.14∗0.25±0.05∗0.67±0.10∗阿帕替尼中剂量组0.42±0.06∗#0.36±0.04∗#1.28±0.17∗#阿帕替尼高剂量组0.24±0.03∗#△0.87±0.16∗#△2.79±0.42∗#△

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阿帕替尼低剂量组比较，#P<0.05；与阿帕替尼中剂量组比较，△P<0.05

图4 甲磺酸阿帕替尼对HCT-116细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响；A:空白对照组，B:阿帕替尼低剂量组，C:阿帕替尼中剂量组，D:阿帕替尼高剂量组

3 讨论

甲磺酸阿帕替尼用于治疗复发性进展期胃腺癌和胃食管交界腺癌[8]。此外，甲磺酸阿帕替尼对非小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌和直肠癌的治疗效果目前正在临床试验中[9]。研究证实，甲磺酸阿帕替尼能够抑制卵巢癌A2780细胞增殖[10]。研究甲磺酸阿帕替尼抑制HCT-116细胞增殖和诱导凋亡的机制，可以更好开发甲磺酸阿帕替尼的药用价值。

PI3K/Akt信号通路在细胞增殖/凋亡过程中发挥重要作用，由多种细胞因子调控，参与包括人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)在内的负调控作用[11]。PI3K是磷脂酰肌醇和肌醇的重要激酶，PI3K可以被细胞表面的受体激活形成p-PI3K,p-PI3K可以激活Akt等下游效应因子，将各种生长因子和细胞因子的信号传递给细胞[12]。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，Akt信号元件经常发生改变[13]。Akt通过抑制凋亡来促进细胞存活，而其磷酸化被认为是结肠癌侵袭性的关键因素，因此，阻断Akt活性的策略在理想情况下会导致细胞增殖抑制和凋亡诱导[14]。研究表明，多酚可能调节Akt通路诱导癌细胞凋亡，通过抑制Akt的磷酸化，使p-Akt的表达减少，促进凋亡过程的进程。PI3K激活下游靶点Akt，介导生物效应[15]。本研究结果显示，甲磺酸阿帕替尼可以抑制PI3K和Akt的磷酸化，减少p-PI3K和p-Akt的表达。

磷酸化Akt可以作用于Bcl-2家族和caspase家族的蛋白，抑制细胞凋亡，进而导致细胞过度生长和增殖[16]。Bcl-2作为一种抗凋亡蛋白，在凋亡信号通路中起着关键作用，Bcl-2可以抑制细胞凋亡，促进细胞增殖[17]。在一些人类肿瘤中发现了高水平的Bcl-2表达，并且Bcl-2表达水平与恶性肿瘤的侵袭性相关[18]。Bax和Bcl-2属于同一个家族，Bax作为促凋亡蛋白，与Bcl-2功能相反，Bax不仅拮抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，而且直接促进肿瘤细胞凋亡[19]。Caspase-9是线粒体凋亡通路的关键因子，活化的Caspase-9可以进一步激活下游的Caspase-3，进而导致肿瘤细胞凋亡[20]。本研究也证实了甲磺酸阿帕替尼可以抑制HCT-116细胞中Bcl-2蛋白的表达，同时促进了Bax和caspase-9的表达，验证了甲磺酸阿帕替尼诱导细胞凋亡的作用。

综上所述，甲磺酸阿帕替尼可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，下调Bcl-2的表达，上调Bax和caspase-9的表达，从而抑制结肠癌细胞的增殖和诱导结肠癌凋亡，为甲磺酸阿帕替尼治疗结肠癌提供了理论依据。