基于网络药理学及分子对接探讨当归补血汤治疗动脉粥样硬化潜在作用机制研究＊

张君冬，尹仁芳，陈 琦，杨 硕

(中国中医科学院中医药信息研究所 北京 100700)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是临床常见的老年性慢性血管炎症疾病，发病率高，治疗复杂困难，易引起冠心病、中风、脑梗死等各类心血管疾病[1]，且发病对象逐渐呈年轻化趋势。目前，针对AS治疗的药物很多，但大多有明显的毒副作用，如常用的阿司匹林和他汀类药物虽能在一定程度上缓解AS的形成，但部分人群长期服用可能会导致大出血、肌痛等并发症[2,3]。

中医认为，动脉粥样硬化可归属“胸痹”“眩晕”“心悸”等范畴，瘀血阻滞、气血亏虚是其主要的发病机制[4]。当归补血汤源自《内外伤辨惑论》，由金元四大家之一的补土派李东垣所创[5]，是临床常用的补气活血经典方，方中黄芪大补脾肺之气，重在补气活血，配以当归养血合营，使阳生阴长，气旺血生。目前，已有研究表明，当归补血汤对于动脉粥样硬化有良好的治疗效果[6-8]，但其具体作用靶标及机制尚缺乏整体性系统性研究。因此，本研究采用网络药理学方法及分子对接技术探究当归补血汤治疗动脉粥样硬化的潜在作用机制，为其深入研究及临床用药提供参考。

1 数据来源与方法

1.1 构建化学成分及蛋白靶点数据库

以“当归”“黄芪”为关键词在TCMSP数据库(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID2.0数据库(http：//www.megabionet.org/tcmid/)中检索，去除重复得到各类药物全部化学成分及其蛋白靶点，设置口服生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18作为活性化合物的筛选条件，然后通过Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org)对靶标蛋白进行标准化，建立各类药物化学成分及其靶点数据库。

1.2 搜集动脉粥样硬化发病靶点

以“atherosclerosis”为关键词，在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)中进行检索，选择物种为“Homo sapiens”建立动脉粥样硬化靶点数据库。

1.3 当归补血汤治疗动脉粥样硬化潜在作用靶点预测

通 过Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)将成分靶点与疾病靶点取交集得到共同靶点即当归补血汤治疗动脉粥样硬化的关键靶点。

1.4 中药-化合物-靶点网络构建

将筛选整理得到当归补血汤成分及关键靶点导入Cytoscape 3.7.1软件(http：//www.cytoscape.org/)构建中药-化合物-靶点网络，基于NetworkAnalyser功能分析出评估节点的重要指标，并根据这类指标找出关键化合物及靶点基因。

1.5 PPI蛋白网络构建

将当归补血汤治疗动脉粥样硬化相关靶点基因上传至在线STRING 11.0平台(http：//string-db.org)，选取Organism=“Homo sapiens”，且打分值≥0.7的高置信度数据，以确保数据的可靠性，最后通过Cytoscape 3.7.1软件，构建PPI蛋白网络。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

本研究在BioMart(http：//www.ensembl.org/index.html)平台基因ID转换的基础上，通过Omicshare(http：//www.omicshare.com/tools/)分析平台对共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，根据P_Value值将富集结果做成可视化气泡图，同时生成化合物-靶点-通路网络图。

1.7 分子对接分析

从蛋白晶体结构数据库(http：//www.rcsb.org)下载靶点蛋白的PDB格式文件。采用Pymol2.3软件删除蛋白分子中的无关小分子后，将蛋白分子导入AutoDock Tools-1.5.6软件删除水分子并添加氢原子最后保存为pdbqt文件。

从PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化合物的sdf格式文件。将小分子化合物导入AutoDock Tools-1.5.6软件删除水分子并添加原子电荷、分配原子类型，将所有柔性键默认可旋转，最后保存为pdbqt文件。

所有的对接实验运用AutoDock Tools-1.5.6软件。在计算过程中，采用0.375间隔的70x70x70点阵模块。使用Lamarckian遗传算法进行分子对接计算，算法如下：150的群体，最大值2500万次能量评估，最高次数为2000，交叉率0.8，突变率0.02，独立对接运行50次，并根据结合自由能评估最终对接结构。对接结果采用Pymol 2.3软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 活性化合物筛选及靶点预测

通过TCMSP数据库、TCMID数据库检索到“当归”“黄芪”中化合物共185个，以OB≥30%且DL≥0.18筛选出活性化合物共22个，预测靶标数量共212个(不含重复靶点)(表1)。

表1 当归补血汤“药物-有效成分-预测靶标”基本信息

2.2 当归补血汤治疗动脉粥样硬化(AS)潜在作用靶点

根据GeneCards数据库Relevance score≥10共筛选得到AS潜在作用靶点148个，通过Venny 2.1.0将成分靶点与疾病靶点取交集共得到36个交叉靶点，即当归补血汤治疗动脉粥样硬化关键靶点(图1)。

图1 当归补血汤和动脉粥样硬化靶点韦恩图

2.3 当归补血汤中药-化合物-靶点网络分析

将36个交叉靶点通过Cytoscape 3.7.1软件(http：//www.cytoscape.org/)构建中药-化合物-靶点网络(图2、表2)。

表2 中药-化合物-靶点网络中关键节点

图2 中药-化合物-靶点网络

中药-化合物-靶点网络共包括52个节点(2个中药节点，14个化合物节点，36个靶点节点)和93条边，每条边则表示节点与节点之间的相互作用关系，节点的度与节点颜色深度成正比，颜色越深，表明该节点在整个网络发挥作用的程度越大。数据库中未查询到对应蛋白靶点的化学成分未参与网络构建。从化合物的角度来看，作用靶点数排名前3的成分为quercetin-槲皮素、kaempferol-山奈酚、isorhamnetin-异鼠李素。从靶点的角度来看，F2-凝血酶、ESR1-雌激素受体、TP53-细胞肿瘤抗原P53均排名靠前。

2.4 PPI网络分析

将STRING 11.0平台得到的36个蛋白相互作用数据导入Cytoscape 3.7.1软件，构建PPI网络，得到一组关联密切的基因群，该基因群可能是当归补血汤治疗动脉粥硬化的核心模块，如图3中共包括36个节点，462条边，节点的平均度值不低于20，字体大小与节点的度成正比，节点大小与节点的介值成正比，度值、介值越大的节点，在整个网络中的重要程度就越高(表3、图3)。

图3 PPI蛋白网络

表3 PPI蛋白网络靶点信息(Degree≥30)

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析(图4)发现当归补血汤治疗动脉粥样硬化主要与以下生物进程相关：①炎症反应(inflammatory response)，②对外部刺激反应的调节(response to external stimulus)，③对含氧化合物的反应(response to oxygen-containing compound)，④细胞因子介导的信号通路(cytokine-mediated signaling pathway)，⑤对有机物质的反应(response to organicsubstance)⑥活性氧化物的代谢过程的调节(reactive oxygen speciesmetabolic process)等。

图4 GO功能富集的生物过程分析

KEGG通路富集分析筛选得到前20条关键信号通路，主要分为以下3类：①与人类疾病相关的通路：心血管疾病(流体剪切力与动脉粥样硬化通路)、内分泌和代谢疾病(AGE-RAGE信号通路)、感染性疾病(疟疾、非洲锥虫病)、癌症(癌症蛋白多糖)、免疫疾病(百日咳、乙型肝炎、利什曼病)②与环境信息处理相关的通路：信号传导通路(TNF信号通路)③与生物体系统相关的通路：免疫系统(IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路等)。为了更准确的说明当归补血汤治疗动脉粥样硬化可能的作用机制，选P值较小的前20个通路构建成分-靶点-通路网络图和可视化气泡图(图5、图6)。由图6可知，TNF、IL1B、IL6、AKT1和流体剪切力与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号、TNF信号通路为该网络的核心调控节点。

图5 KEGG通路可视化气泡图

图6 成分-靶点-通路网络图(棱形代表化合物，圆形代表靶点，倒三角代表信号通路)

2.6 分子对接

一般来说，配体与受体结合能越低，对接活性越大，结构越稳定。将中药-化合物-靶点网络中排名前3的核心活性化合物与成分-靶点-通路网络图中排名前4的蛋白靶点进行分子对接，进一步明确其发挥效用的治疗机制(表4)。

表4 当归补血汤枢纽靶点与核心化合物结合亲和力

2.6.1 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与TNF相互作用分析

肿瘤坏死因子是一种重要的细胞因子，具有强大的促炎和免疫调节作用，在多种疾病中往往过度表达，已成为自身免疫性疾病的治疗靶点。目前用于靶向TNF治疗的大部分都是生物大分子，因此小分子抑制剂的发现很有价值。研究的小分子主要分为直接与TNF结合，抑制TNF和TNFR1之间相互作用来调节相关信号途径。本研究第一次用计算的方法发现TNF抑制剂。根据槲皮素，山奈酚，异鼠李素与TNF蛋白结合模式可以发现，潜在的结合位点包括LEU-120，GLY-121，SER-60，TYR-119，TYR-151等氨基酸残基，与Molly M.He等[9]所发现的TNF蛋白结构的活性位点的残基基本一致，表明3个化合物与TNF蛋白匹配度高，是十分有潜力的抑制剂，特别是化合物异鼠李素能够与TYR-151，SER-60形成氢键，氢键距离分别为2.5Å2.3Å，2.1Å(图7)，氢键长度短，结合能力强。进一步发现，3种化合物的苯环与部分残基可以形成p-π及π-π共轭。这些氢键及共轭的存在说明3种化合物均能够很好的匹配TNF蛋白的活性口袋，且匹配度高，而且与已知的的活性残基有着较强的氢键作用，因此这3个化合物都可能是TNF靶点的潜在的抑制剂。

图7 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与TNF蛋白对接。

2.6.2 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与IL1B相互作用分析

槲皮素，山奈酚，异鼠李素与IL1B蛋白的结合能分别为-6.23 kcal·mol-1，-6.26 kcal·mol-1，-6.76 kcal·mol-1。潜在的结合位点主要有GLN-149，SER-5，ASN-7，SER-152，TYR-24等氨基酸残基，3种化合物均为黄酮母体，结构具有高度的相似性，酚羟基均可以与氨基酸形成氢键，如山奈酚的酚羟基与SER-5，ASN-7，SER-152的活性基团形成的氢键，氢键长度分别为2.6Å，2.4Å，2.1Å(图8)。3种化合物与蛋白的活性位点形成的氢键距离均较短，表明化合物与蛋白的的口袋结合能力较强，另外化合物之间相似性也较高，结合能也相近。因此，3种化合物均可以与IL1B蛋白形成稳定的复合物，可能是潜在的靶点蛋白的抑制剂。

图8 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与IL1B蛋白对接

2.6.3 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与IL6相互作用分析

根据槲皮素，山奈酚，异鼠李素与IL6的结合模式可知，潜在的结合位点包括GLN-105，TYR-145，SER-110，GLN-112，TYR-143，LEU-104，THR-111，LYS-150等氨基酸残基。3种化合物含有多个活性基团(酚羟基及羰基)均可以与氨基酸形成多个氢键，且氢键距离较短，平均为2.7Å(图9)。这些氢键的存在说明3种化合物能够很好的匹配IL-6蛋白的活性口袋，可以有效地提高化合物在口袋中的稳定性，从而发挥抑制作用。

图9 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与IL6蛋白对接

2.6.4 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与AKT1相互作用分析

槲皮素，山奈酚，异鼠李素与AKT1对接结果表明，3个化合物和AKT1均存在较强的结合作用，结合能力强弱分别为：异鼠李素＞山奈酚＞槲皮素。通过结合位点汇总分析，3种化合物与AKT1蛋白结合的残基有7个，分别是GLY-19、LEU-191、ALA-41、GLY-40、GLY-17、GLY-65、THR-42。槲皮素，山奈酚，异鼠李素与AKT1蛋白的结合能分别为-7.43 kcal·mol-1，-7.38 kcal·mol-1，-7.95 kcal·mol-1(图10)。其中，槲皮素与AKT1蛋白的活性残基形成4个氢键，多于另外2个化合物，说明该化合物与蛋白口袋结合较强。这些氢键及其他相互作用的存在说明3种化合物均能够很好的匹配AKT1蛋白的活性口袋。

图10 槲皮素，山奈酚，异鼠李素与AKT1蛋白对接

3 讨论

动脉粥样硬化是以脂质沉积、平滑肌细胞增殖(SMCs)、细胞凋亡、坏死以及纤维化为特征的一种慢性炎症疾病[10]，大多起因于人群缺乏运动、膳食结构不合理、吸烟酗酒等不健康的生活方式导致的高血压、高血脂、糖尿病症。

本次研究结果来看，Degree排名靠前的化合物是quercetin-槲皮素、kaempferol-山奈酚、isorhamnetin-异鼠李素。槲皮素具有抗炎、抗氧化、降血压、降血脂及免疫调节的作用[11]，可抑制泡沫细胞的形成来降低动脉粥样硬化损伤面积和斑块大小[12]。山奈酚可以显著抑制脂质过氧化，清除超氧化物阴离子[13-15]。异鼠李素可抑制TNF-α、IL-6发挥抗炎作用，通过降低或抑制ox-LDL形成、VEC损伤、巨噬细胞形成、脂质堆积、VSMC增生与迁移及血栓形成等重要环节发挥抗AS作用[16]。据相关文献报道，氧化应激、炎症反应及高脂血症是导致动脉粥样硬化的重要因素[17]，因此槲皮素、山奈酚、异鼠李素3种化合物在一定程度上可以预防和治疗动脉粥样硬化。

PPI蛋白网络中共包含36个核心靶点，主要以白细胞介素(IL6、IL1B、IL10)、基质金属蛋白酶(MMP9、MMP2)、细胞黏附分子(VCAM1、ICAM1)及肿瘤相关基因(TNF、AKT1等)为主。IL10是由TH2细胞产生的抗炎因子，可抑制各类炎性介质(如IL6、IL1B)同时促进其他抗炎因子的分泌，有效减轻炎症对心血管损伤。基质金属蛋白酶由巨噬细胞分泌产生，尤以MMP2、MMP9最为重要，可降解细胞外基质，使得AS斑块纤维帽变薄容易破裂。已有研究发现，抑制MMP2、MMP9的活性和表达可显著降低循环总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，其可能机制是通过增强SMC以达到增强斑块稳定性的作用[18]。肿瘤坏死因子(TNF)可增强内皮细胞通透性、促进SMC的增生和基质金属蛋白酶的表达[19]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)参与多种生物学过程，包括代谢，增值，细胞存活，生长，血管生成等，是PI3K/AKT信号通路中的核心因子。总体来看，所涉及靶点主要在炎症反应、脂质代谢、细胞因子、细胞增殖分化、凋亡以及组织修复发挥重要作用。靶点与靶点之间联系密切，也体现了当归补血汤具有多靶点协同治疗动脉粥样硬化的优势。

富集分析结果来看，主要集中在心血管疾病、内分泌和代谢疾病、感染性疾病等方面。由此推断当归补血汤中的活性成分可能通过作用于免疫系统、内分泌系统等相关靶点，调节与炎症、心血管疾病、内分泌和脂质代谢等相关信号通路，达到治疗动脉粥样硬化的作用。

KEGG结果显示关键通路中，流体剪切力与动脉粥样硬化通路可以调控KLF2和内皮一氧化氮合酶(eNos)来抑制黏附分子如细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达来发挥抗炎、抗黏附，维持血管内环境稳定性的效果[20]。AGERAGE信号可激活核因子-kB(NF-kB)信号通路，NFkB可促进促炎性细胞因子(如IL-1，IL-6和TNF)以及与AS相关的基因VEGF的表达[21]，从而加剧AS的新成，提示当归补血汤有可能通过调节AGE-RAGE信号通路来抑制NF-kB信号通路激活减少炎症因子释放达到抗AS的作用。此外，Toll样受体(TLR)依赖性信号通路、IL-17信号通路在一定程度上均参与了炎症反应。氧化应激损伤和脂质代谢紊乱也是动脉粥样硬化形成的主要原因，当归补血汤能一定程度上提高氧化应激状态下的细胞自噬水平，促进损伤后的EPCs增殖、迁移能力与血管形成能力[22]，降低血清TC、TG、LDL-C，升高HDL-C，从而调节脂代谢紊乱[23-24]，修复血管损伤。

分子对接结果表明，3种度值较高的活性化合物与4类枢纽靶点蛋白均存在较强的结合作用，而其中异鼠李素和AKT1蛋白结合所需的能量最低，结合性最强。槲皮素，山奈酚，异鼠李素均为黄酮类化合物，有着较多的氢键受体与氢键供体，这有利于与靶点蛋白形成稳定的氢键，从而使小分子化合物能够稳定的结合在蛋白的活性位点。进一步研究发现，槲皮素，山奈酚，异鼠李素与每一个蛋白的结合模式基本相似，这也间接表明了分子对接技术的稳定性。另外，3个化合物与蛋白活性残基还存在疏水相互作用和范德华力以及形成共轭结构。因此，这些作用力可以有效地使小分子固定在活性中心，有利于提高化合物在蛋白活性口袋的稳定性，是潜在靶点蛋白的抑制剂。

4 总结与展望

综上，本研究采用网络药理学方法及分子对接技术阐述当归补血汤治疗动脉粥样硬化多成分、多靶点协同作用的机制，结果显示，当归补血汤中槲皮素、山奈酚、异鼠李素等活性化合物可能通过作用于TNF、IL1B、IL6、AKT1等相关枢纽靶点，调节流体剪切力、AGE-RAGE、NF-kB及氧化应激损伤和脂质代谢等相关信号通路，达到抗炎、抗黏附、调节脂代谢紊乱，修复血管损伤的功效。本研究数据来源主要是基于国内已有的公共数据库进行研究，数据的可靠性以及完整性对预测结果有着重要影响[25]，此外，本研究中当归补血汤中所有化学成分主要来自收集黄芪、当归单味药化学成分进行合并得到，而黄芪、当归在煎煮过程中能否产生新的化学成分及经体代谢前后成分种类差异仍需进一步研究。