基于血管生成探讨补肾养精颗粒对早发性卵巢功能不全大鼠模型的影响＊

张 芳，刘 震，于 潇，丁 怡，张毅然，石雅馨，刘金星＊＊

(1.山东中医药大学第一临床医学院 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院 济南 250014)

早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性40岁之前出现4个月以上的闭经或月经稀发，且连续2次的血清FSH水平＞25IU/L(间隔4-6周)[1]。其临床以月经异常为主，可伴有潮热、盗汗、性交不适，阴道干涩，睡眠不佳等雌激素缺乏的症状[2]，甚至引起不孕，发病率为1%[3]，且逐年上升，是妇科常见的疑难病种，严重影响女性的身心健康和生活质量。近年来，随着社会的快速发展，工作节奏的加快，加之环境因素等综合影响，POI的发病率逐年升高，且有向低龄化发展的趋势[4]。目前针对POI缺乏有效的治疗手段，常规激素补充治疗可缓解患者雌激素缺乏的症状，但无法重建患者卵巢功能。在新版2017早发性卵巢功能不全的临床诊疗中国专家共识，指出“中药可做为一种治疗POI的非激素药物”[5]。

目前引发POI的机制尚不明确，现代医学主要从遗传因素、医源性因素、免疫因素、环境因素等进行研究。POI是一个过程，绝非一个事件。各种病因引起的POI，均以卵巢中的卵泡发育不良或闭锁太快为特征。初级卵泡(致密无血管)逐渐发育为次级卵泡(有血管)的过程中，卵泡液的形成及卵泡的成熟均离不开血管的供养，卵巢血管生成对卵泡发育起着至关重要的作用[6]。现代研究发现，卵巢血流灌注指标对卵巢储备功能具有一定预测作用，POI患者的卵巢血流灌注参数高于健康妇女，且血清VEGF含量较低。

补肾养精颗粒具有补肾填精之效，可改善患者卵巢功能，提高妊娠率[7]。历代妇科医家均倡导“女子以血为本”，就“血”的物质属性——滋养、循行功能而言，上述之“血”与血液之“血”具有一定的相似性。基于二者相似的功能及精血同源理论，在上山东省重点研发计划(2019GSF108208)的支撑下，预从血管生成及凋亡相关因子角度进一步阐述补肾养精颗粒改善POI模型大鼠卵巢功能的机制。

随机分组空白组模型组BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High补佳乐组动情周期筛选1-7天造模生理盐水灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃50 mg·kg-1雷公藤多苷灌胃8-21天药物干预生理盐水灌胃生理盐水灌胃1.75 g·kg-1补肾养精颗粒低剂量灌胃3.50 g·kg-1补肾养精颗粒中剂量灌胃7.00 g·kg-1补肾养精颗粒高剂量灌胃0.1 mg·kg-1补佳乐灌胃22-36天

1 材料

1.1 实验药物

①雷公藤多苷片：10 mg/片(远大医药黄石飞云制药有限公司，20190110)；②戊酸雌二醇片(补佳乐)，1 mg/粒，拜耳医药保健有限公司广州分公司分包装生产，生产批号：352A；③补肾养精汤：熟地12 g、当归12 g、白芍12 g、川芎9 g、菟丝子18 g、枸杞子15 g、盐车前子6 g、制五味子9 g、覆盆子9 g、川牛膝15 g、醋香附12 g、炒枳壳12 g、党参12 g、炙淫羊藿12 g、盐知母12 g、益母草15 g，广州一方药业中药免煎颗粒。

1.2 动物

7-8周龄SPF级SD雌性大鼠(购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号:SYXK(鲁)2014 0007)，体质量(180-200)g。动物饲养环境：山东中医药大学附属医院动物房饲养，将室温控制在20℃-24℃，相对湿度维持在45%-55%。造模时间均选择大鼠动情前期。

1.3 试剂

ELISA试剂盒：E2(RA20666)、AMH(RA20211)、NF-κB(RA20170)、MMP-2(RA20502)、Caspase-3(RA20292)、Caspase-9(RA20290)均由武汉贝茵莱生物科技有限公司提供；全蛋白提取试剂盒(BC3710-100T，)由solarbio，提供；MMP-2(bs-4599R)、Caspase-3(Bsm-33284M)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(bs-40295G-HRP)，均由Bioss提供。

1.4 仪器

全波长酶标仪，赛默飞世尔科技有限公司；电泳仪，美国伯乐公司；化学发光成像仪，日本富士公司；显微镜，徕卡生物系统有限公司。

2 方法

2.1 动物分组

常规饲养1周适应环境后，挑选动情周期正常大鼠，随机分为正常组、POI模型对照组、补肾养精颗粒高剂量组(BSYJKL-High)，补肾养精颗粒中剂量组(BSYJKL-Medium)，补肾养精颗低剂量组(BSYJKLLow)，补佳乐组，各10只，分别编号、称重。

2.2 动物干预

模型制备：按照参考文献[8]，空白组大鼠予生理盐水灌胃；其他各组大鼠给予雷公藤多苷混悬液50 mg·(kg·天)-1灌胃，连续14天。

药物干预：中药192 g，相当于配方颗粒33.3 g。参照人与动物之间药物剂量换算方法，分别灌服补肾养精颗粒1.75 g·(kg·天)-1、3.50 g·(kg·天)-1、7.0 g·(kg·天)-1，补佳乐0.1 mg·(kg·天)-1，连续15天。余两组予生理盐水灌胃。

2.3 取材时点

补肾养精颗粒干预的第1、3、5、7、9、11、13天阴道涂片观察动情周期的变化；药物干预结束48 h内处死大鼠。

2.4 检测指标

用10%水合氯醛注射大鼠腹腔，麻醉后固定大鼠，将大鼠腹中部皮肤去毛，常规消毒，铺巾，切口进腹，暴露卵巢，肉眼大体观察大鼠卵巢情况后，剪取大鼠卵巢，并采集腹腔静脉血。

表2 补肾养精颗粒对大鼠动情周期的影响(±s,n=10)

表2 补肾养精颗粒对大鼠动情周期的影响(±s,n=10)

注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组空白组模型组BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High补佳乐组动情周期/天3.8±1.08 8.4±0.84＊＊7.00±0.67＊＊△△5.70±0.94＊＊△△6.6±1.07＊＊△△4.8±0.79＊△△

表4 补肾养精颗粒对POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影响(±s,n=4)

表4 补肾养精颗粒对POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影响(±s,n=4)

注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01.

分组空白组模型组BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High补佳乐组NF-κB/(umol·L-1)1.18±0.01 0.07±0.04＊＊0.60±0.06＊＊△△1.28±0.10△△1.22±0.06△△1.14±0.02△△MMP-2/(ng·mL-1)1.22±0.12 0.76±0.24＊＊0.92±0.12＊1.05±0.15△0.83±0.11＊＊0.99±0.17

2.4.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

采用ELISA检测各组大鼠血清E2、AMH及NFκB、MMP2、Caspase-3、Caspase-9水平。取腹腔静脉血，室温放置1 h后，离心机中1000 rpm离心15 min用移液器取出血清，用武汉贝茵莱生物科技有限公司的试剂盒进行ELISA分析，在450 nm处读取光密度，通过标准曲线计算上述指标浓度。

2.4.2 Western Blot分析

根据全蛋白提取试剂盒说明书研磨卵巢组织，离心获得上清液，加入1×loading buffer进行蛋白变性处理。将蛋白样品置入10%的SDS-PAGE胶加样孔内，采用湿转，转膜电流为260 mA，转膜时间为30-60 min，然后在室温下用5%脱脂奶粉将其封闭1 h。分别使用MMP-2、MMP-9、VEGF、Caspase-3抗体孵育过夜，继室温孵育二抗1 h后采用极超敏的化学发光底物进行显影，利用image J图像分析软件对图像的光密度进行了分析。

2.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件，计量资料采用均数±标准差(±s)形式表示，采用t检验，多组间比较，符合正态分布的采用方差分析，不符合正态分布的采用秩和检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

表3 补肾养精颗粒对血清E2、AMH的影响(±s,n=4)

表3 补肾养精颗粒对血清E2、AMH的影响(±s,n=4)

注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组空白组模型组BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High补佳乐组E2/(pg·mL-1)77.72±12.49 59.70±16.70＊67.32±12.72 76.73±2.80△77.84±11.82△66.62±5.14 AMH/(ng·mL-1)4.21±0.24 3.20±0.60＊3.75±0.59 4.11±0.57△4.12±0.80△3.94±0.22

表5 补肾养精颗粒对POI模型大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影响(±s,n=4)

表5 补肾养精颗粒对POI模型大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影响(±s,n=4)

注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组空白组模型组BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High补佳乐组Caspase-3/(ng·mL-1)8.88±0.95 13.02±0.24＊＊13.42±1.70＊＊10.82±1.24＊△△12.11±0.62＊＊10.73±0.83＊△△Caspase-9/(ng·mL-1)13.14±1.53 16.66±1.45＊＊16.39±1.47＊＊15.20±1.92 13.45±1.70△△14.07±0.66△

3 结果

3.1 补肾养精颗粒对大鼠动情周期的影响

根据参考文献[9]，判定大鼠动情周期。与空白组相比，模型组动情周期明显延长(P＜0.05)；与模型组相比，补肾养精颗粒低剂量、中剂量、高剂量，补佳乐明显缩短(P＜0.05)。提示补肾养精颗粒可缩短POI模型大鼠的动情周期。

3.2 补肾养精颗粒对血清E2、AMH的影响

在E2、AMH方面，与空白组相比，模型组明显降低(P＜0.05)；与模型组相比，补肾养精颗粒中剂量组、高剂量组明显升高(P＜0.05)，且与空白组无明显统计学差别(P＞0.05)。提示补肾养精颗粒中、高剂量可提高POI模型大鼠E2、AMH水平。

3.3 补肾养精颗粒对POI模型大鼠血清NF-κB、MMP-2的影响

在NF-κB、MMP-2方面，模型组均较空白组明显降低(P＜0.01)；与模型组相比，补肾养精颗粒中、低、高剂量、补佳乐组的血清NF-κB浓度明显升高(P＜0.01)，以补肾养精颗粒中剂量组最佳，且与空白组无明显统计学差异(P＞0.05)。与模型组相比，补肾养精颗粒中剂量组的血清MMP-2明显升高(P＜0.05)，且与空白组无明显统计学差异(P＞0.05)。提示补肾养精颗粒可提高POI模型大鼠NF-κB、MMP-2水平。

图1 蛋白条带

3.4 补肾养精颗粒对POI大鼠血清Caspase-3、Caspase-9的影响。

在Caspase-3、Caspase-9方面，POI模型组明显较空白组升高(P＜0.05)，与模型组相比，补肾养精颗粒中剂量组、补佳乐组的血清Caspase-3浓度明显降低(P＜0.05)，但仍高于空白组(P＜0.05)；补肾养精颗粒高剂量组，补佳乐组血清Caspase-9明显低于模型组，且与空白组无明显统计学差异(P＞0.05)。提示补肾养精颗粒可降低POI模型大鼠Caspase-3、Caspase-9水平。

3.5 补 肾 养 精 颗 粒 对MMP-2、MMP-9、VEGF、Caspase-3蛋白的影响

由图2可见，模型组的MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白含量均低于空白组，而Caspase-3明显升高(P＜0.01)；由图2-A可见，补肾养精颗粒低剂量组、中剂量组的MMP-9蛋白含量明显高于模型组(P＜0.05)；由图2-B、C可见，补肾养精颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组的MMP-2、VEGF含量明显高于模型组(P＜0.05)；由图2-D可见，各治疗组的Caspase-3含量明显低于模型组(P＜0.01)。提示补肾养精颗粒可提高POI模型大鼠卵巢组织中MMP-2、MMP-9、VEGF的蛋白表达，并降低Caspase-3的表达。

图2 目的蛋白平均光密度

3.6 HE染色

由图3可见，空白组卵泡体积较大，各级卵泡及颗粒细胞发育良好，间质未见明显的炎性细胞浸润及纤维化发生，血管丰富。模型组大鼠泡体积较小，各级卵泡数目减少，闭锁卵泡增多，间质内可见少量炎性细胞浸润，血管减少；补肾养精颗粒低剂量组及中剂量组，卵泡发育及血管分布情况优于模型组，但与空白组有差别；补肾养精颗粒高剂量组及补佳乐组卵泡体积较大，各级卵泡及颗粒细胞发育良好，血管丰富，与空白组无明显差别。提示补肾养精颗粒可促进POI模型大鼠的卵泡发育，增加卵泡数目。

图3 HE染色图片

表6 补肾养精颗粒对卵泡的影响(±s,n=5)

表6 补肾养精颗粒对卵泡的影响(±s,n=5)

注：与空白组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

分组空白组模型组BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High补佳乐组始基卵泡10.80±0.84 7.20±0.84＊＊8.20±0.84＊＊8.60±0.89＊＊△9.60±1.14△△9.80±1.30△△窦前卵泡8.40±0.89 6.40±0.55＊＊6.80±0.84＊＊7.20±0.84＊7.80±0.84△8.20±0.84△△窦状卵泡4.8±0.84 3.2±0.45＊＊3.6±0.55＊＊3.8±0.84＊4.2±0.45△4.4±0.55△△闭锁卵泡4.6±0.89 8.8±0.84＊＊6.8±0.84＊＊△△6.2±0.84＊＊△△5.4±0.55△△5.2±0.45△△

4 讨论

POI属于中医学“月经后期”“闭经”“经断前后诸证”“不孕”等范畴。多数中医学者认为本病以肾虚为主，肾虚是早发性卵巢功能不全的主要病机，补肾为其治疗大法[10]。中医药辨证治疗能有效消除临床症状、改善卵巢储备功能及促进卵母细胞成熟和排出，临床疗效认可度较高，正成为POI极具潜力的治疗方案，传统的汤药、现代的中成药，治疗POI均有明确的效果[11,12]。

山东名中医药专家，本研究团队负责人刘金星教授，在治疗POI(既往所称“卵巢早衰”)30多年的临床实践基础上，基于“肾主生殖”理论创制“补肾养精颗粒”，由四物汤、五子衍宗丸及二仙汤加减而成。方中四物汤养血，五子衍宗丸补肾益精，使精血互生；淫羊藿补肾温阳，取其阳中求阴之功，以增强补肾填精之效；炒知母泻火坚阴，与淫羊藿相配，以制约淫羊藿温热之性，取淫羊藿阳中求阴之功而不助虚热。全方共奏补肾填精之效。

目前血清E2、AMH以及动情周期的改变是评定大鼠卵巢储备功能的重要指标，予雷公藤多苷片诱导后POI模型大鼠卵泡募集和选择过程异常，表现为E2、AMH水平下降，动情周期延长。本研究发现，与空白组相比，POI模型大鼠的血清E2、AMH表达下降，予补肾养精颗粒干预后二者血清水平升高，动情周期恢复，卵巢储备功能改善。提示补肾养精颗粒可改善卵泡募集和选择。

妇女正常的月经来潮、胎儿的孕育及分娩、乳汁的分泌均以血为用，卵巢的功能亦受到血管的结构及血流的影响[13]。妇女生理以“数脱血、耗血”为特点，又常处于不足于血的生理状态，POI患者更表现为“精血亏虚”的病理状态。POI患者不足于血，失于濡养，其理化指标表现为卵巢的血流灌注参数偏高，而卵巢血管化指数、血流指数、血管化血流指数偏低[14]。予雷公藤多苷诱导后，POI模型大鼠卵巢间血管分布较少，卵泡发育不良，成熟卵泡减少，与张永方的研究相符[15]。予补肾填精之效的补肾养精颗粒干预后，血管分布增加，卵泡发育改善，且成熟卵泡增多。

中医之“血”与西医之“血”存在交汇点：具有滋润、濡养作用，并周流全身。VEGF可能为二者潜在的交汇点，可促进微毛细血管(卵泡周围)的生成，为血液中的FSH和LH作用于更多的卵泡提供便利条件，与卵泡的发育与成熟息息相关。且VEGF的周期性变化与女性月经周期中气血变化具有一定的相似性：在经后期至排卵期，血气渐复，而VEGF在卵泡颗粒细胞及膜细胞中的表达逐渐增强。现代药理研究发现雷公藤具有抑制细胞增殖和血管生成的作用[16]，该研究，予大鼠雷公藤多苷诱导后，模型组大鼠卵巢内VEGF呈现低表达，与徐文君研究相符[17]。予补肾养精颗粒干预后可提高卵巢组织内VEGF的蛋白表达量。提示补肾养精颗粒可通过补益精血提高VEGF的表达，参与血管新生，改善卵巢功能。

细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)周期性的重建是维持卵巢的正常功能的必要条件，参与了卵泡的发育及闭锁过程。MMP-2、MMP-9是ECM降解过程中最主要的蛋白水解酶，存在于卵泡的特定细胞和组织上[16]。MMP-2、MMP-9可由发育中的卵泡分泌，且参与了血管的生成，予大鼠雷公藤多苷诱导后，大鼠的MMP-2、MMP-9表达降低，可能与大鼠各级卵泡及血管分布减少有关，予补肾养精颗粒干预后，大鼠卵泡数目及血管分布增多，且卵巢组织中MMP-2、MMP-9的蛋白表达增高，可能与补肾养精颗粒能促进卵泡发育及血管生成有关。

NF-κB存在范围广泛，亦表达于卵巢组织中，主要是通过调控多种促血管生成因子如VEGF、MMP-2、MMP-9的转录与促进血管平滑肌细胞的增殖来参与血管的形成。模型组大鼠血清NF-κB的浓度明显低于空白组，提示POI模型组大鼠血管生成受限；予补肾养精颗粒干预后可明显提高其血清含量，提示补肾养精颗粒可能通过调控NF-κB的表达，参与血管生成。

卵泡的正常发育不受单个卵泡闭锁的影响，但大量卵泡闭锁(高于生理代谢速度)则会引起POI的发生。Caspase家族成员是最终启动细胞凋亡的执行者，Caspase-3、Caspase-9是细胞凋亡的必经途径，与卵泡闭锁密切相关。本研究发现予雷公藤多苷片诱导后，POI模型大鼠的闭锁卵泡数目增多，且卵巢组织中Caspase-3、Caspase-9表达升高，而予补肾养精颗粒干预后闭锁卵泡数目减少，且Caspase-3、Caspase-9表达降低，提示补肾养精颗粒可抑制POI模型大鼠卵泡闭锁与凋亡。

综上所述，“女子以血为本”中的“血”是抽象的、不可定量、定性观察，但与西医学之“血”具有相似之性。雷公藤可抑制血管生成，卵泡失于血的濡养作用，则发育受阻，甚至闭锁；补肾养精颗粒具有补肾填精之效，精血同源，故补肾养精颗粒可通过升高血管生成相关因子NF-κB、MMP-2、MMP-9、VEGF的表达，降低凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-9的表达，进而改善血清E2、AMH水平，促进卵巢血管的形成及卵泡的发育。