分泌型糖蛋白Reelin对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用△

王艳婷 金学民 李晓华 赵朝霞

青光眼是一种以视神经损伤、视野缺损、视网膜神经节细胞(RGC)变性或凋亡为特征的视网膜神经病变[1-2]。研究表明，缺血、缺氧、谷氨酸兴奋性毒性、神经营养因子缺乏、氧化应激等均会导致RGC凋亡，引起青光眼[3-4]。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)通过与细胞表面特异性受体结合，诱发细胞谷氨酸兴奋性毒性和氧化应激反应，通常用NMDA诱导动物青光眼模型或RGC损伤模型[5]。Reelin属于分泌型糖蛋白，与受体结合后可调节神经细胞突触功能[6]。Reelin与神经系统疾病(阿尔茨海默病或帕金森病)的发生密切相关[7-8]。然而，Reelin与青光眼中RGC变性损伤的关系鲜有报道。视网膜被认为是中枢神经系统的一部分，有“外周脑”之称。青光眼患者的视网膜神经病变与阿尔茨海默病等疾病类似，都以神经元的凋亡、变性为特征。本研究我们利用NMDA诱导RGC损伤，制作大鼠青光眼模型，进而探讨Reelin在青光眼发生中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器大鼠RGC-5(中国科学院上海细胞库)，含双抗的DEME培养基、不含双抗的DEME培养基、胎牛血清(上海碧云天生物技术有限公司)，NMDA、糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)小鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG二抗(英国Abcam公司)，Annexin V FITC/碘化丙啶(PI)凋亡试剂盒(德国美天旎公司)，兔抗鼠Reelin一抗(PA5-78413)、兔抗鼠磷酸化-Tau蛋白(p-Tau)一抗、鼠抗鼠细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)一抗、山羊抗兔IgG二抗(美国Invitrogen公司)，Reelin抑制物、Reelin类似物和Reelin阴性对照序列由上海吉玛基因公司合成，Trizol试剂、Lipofectamine 2000(美国Sigma公司)。

1.2 实验分组将大鼠RGC-5分为对照组、NMDA组、Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组。对照组细胞常规培养，NMDA组细胞使用NMDA诱导RGC-5损伤,Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组细胞使用NMDA诱导RGC-5损伤后分别转染Reelin类似物、阴性对照和抑制物。

1.3 方法

1.3.1 RGC-5复苏与培养将细胞解冻、复苏，用含体积分数10%的胎牛血清和10 g·L-1双抗的DEME培养基重悬细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d用胰蛋白酶消化传代1次。取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3.2 NMDA诱导RGC-5损伤将对数生长期细胞用含体积分数1%胎牛血清的DEME培养基饥饿处理24 h，将细胞分为对照组和NMDA组，对照组细胞不作任何干预，NMDA组细胞培养基中加入终浓度为100 μmol·L-1的NMDA，每组设置6个复孔，作用24 h后，Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测细胞内Reelin、p-Tau、GSK-3β和CDK5蛋白表达。

1.3.3 细胞转染将NMDA诱导损伤后的RGC-5分为Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组。转染前24 h将待转染细胞转移至6孔板中，调整细胞密度约为500×106个·L-1，待细胞融合至80%以上时，按照Lipofectamine 2000说明书中所示步骤，将Reelin类似物、Reelin阴性对照和Reelin抑制物与Lipofectamine 2000分别用DEME培养液稀释，室温孵育5 min，然后将各稀释液分别与Lipofectamine 2000稀释液混合，室温孵育15 min。之后将上述混合液分别加入Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组细胞培养液中，每组设置6个复孔，6 h后弃掉旧培养液，换为新鲜培养基，继续培养24 h后，用Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot检测细胞内Reelin、p-Tau、GSK-3β和CDK5蛋白表达情况。

1.3.4 Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡率将细胞用胰蛋白酶消化，预冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，离心后重悬于200 μL 结合缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，冰浴条件下避光反应15 min，继续加入300 μL 结合缓冲液，上流式细胞仪前加入5 μL PI，1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。左下象限为活细胞，左上象限为死亡细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞，细胞凋亡率取早期凋亡率和晚期凋亡率之和。每个实验结果独立重复3次。

1.3.5 Western blot检测细胞内Reelin、p-Tau、GSK-3β和CDK5蛋白表达用RIPA裂解液提取总蛋白，加入聚丙烯酰胺凝胶加样孔进行电泳，使蛋白转移至PVDF膜，50 g·L-1脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST温和洗膜3 min后加入相对应的一抗Reelin(11000)、p-Tau(1500)、GSK-3β(11000)、CDK(1500)，54 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次,每次10 min，加入相应二抗(12000)，室温下孵育1 h，TBST洗涤3次,每次10 min，加入配制好的ECL发光液，避光孵育5 min，用化学发光凝胶成像仪采集图片信息，用Image pro plus 6.0软件进行灰度值分析，以β-actin为内参，分析目的蛋白条带灰度值。

1.4 统计学方法用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均值±标准差表示，各组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 NMDA对RGC-5细胞凋亡的影响对照组RGC-5细胞凋亡率为(9.30±0.74)%，NMDA组为(25.40±1.13)%，NMDA组高于对照组，差异有统计学意义(t=6.311,P<0.001)(见图1)。

图1 对照组和NMDA组细胞凋亡情况

2.2 NMDA对RGC-5内Reelin、p-Tau、GSK-3β、CDK5蛋白表达的影响NMDA组RGC-5内Reelin蛋白表达水平低于对照组，p-Tau、GSK-3β和CDK5蛋白表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(见图2和表1)。

图2 Western blot检测对照组和NMDA组RGC-5内各种蛋白表达

表1 对照组和NMDA组RGC-5内Reelin、p-Tau、GSK-3β、CDK5蛋白相对表达量

2.3 Reelin对RGC-5细胞凋亡的影响Reelin类似物组细胞凋亡率为(9.23±0.24)%，低于Reelin阴性对照组[(14.33±1.02)%]和Reelin抑制物组[(26.81±1.15)%]，各组细胞凋亡率差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见图3)。

图3 Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组细胞凋亡情况

2.4 Reelin对RGC-5内p-Tau、GSK-3β、CDK5蛋白表达的影响Reelin类似物组RGC-5内p-Tau、GSK-3β蛋白表达水平均低于Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组，Reelin抑制物组RGC-5内p-Tau、GSK-3β蛋白表达水平均高于Reelin阴性对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；CDK5蛋白表达水平在3组中基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)(见图4和表2)。

图4 Western blot检测Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组RGC-5内各种蛋白表达

表2 Reelin类似物组、Reelin阴性对照组和Reelin抑制物组RGC-5内p-Tau、GSK-3β、CDK5蛋白表达情况

3 讨论

RGC变性和凋亡是青光眼的主要病理特征。RGC由胞体、轴突和树突组成，负责将视觉信息传递至中枢神经系统[9]。Reelin属于分泌型糖蛋白，通过与其受体结合，使细胞质衔接蛋白磷酸化，进而激活下游通路[6,10]。Reelin在神经发育的早期主要与神经细胞的迁移过程有关，发育后期主要起到调节突触功能的作用[11]。研究发现，Reelin蛋白在阿尔茨海默病、抑郁症、帕金森病等中枢神经系统疾病患者中呈现异常表达[7-8,12]。青光眼与阿尔茨海默病、抑郁症等多种中枢神经系统疾病存在病理相似性，都以中枢神经元的变性、凋亡为特征。研究发现，青光眼合并阿尔茨海默病患者其病程进展会加快[13]。本研究以NMDA诱导RGC损伤模型，探讨Reelin在RGC损伤中发挥的作用。本研究结果显示，NMDA组RGC-5内Reelin的表达水平低于对照组；转染Reelin类似物的RGC-5细胞凋亡率低于转染Reelin阴性对照和Reelin抑制物的细胞。以上实验结果提示，Reelin对RGC-5具有保护作用，Reelin表达下降可能是导致RGC-5损伤的原因之一。

Reelin的神经保护作用主要体现在阻止Tau蛋白的磷酸化[14]。Tau蛋白是神经细胞中的主要微管相关蛋白，对神经细胞骨架稳定起重要作用。Tau蛋白广泛分布在正常视网膜中，磷酸化的Tau蛋白在正常视网膜组织中几乎不表达[15]。RGC轴浆运输依赖于细胞骨架的微管系统，当Tau蛋白被磷酸化后，RGC内微管系统被破坏，生长锥塌陷，进而加速RGC变性凋亡[16]。因此，异常磷酸化的Tau蛋白在RGC的变性中起重要作用。本研究发现，在NMDA刺激后，RGC-5内p-Tau蛋白的表达增加，同时伴随细胞凋亡率升高，与Reelin表达趋势相反。进一步抑制RGC-5内Reelin的表达后，Tau蛋白磷酸化随之升高，而RGC-5内Reelin的表达上调后，Tau蛋白磷酸化随之下降，提示RGC损伤变性可能与Reelin表达下调后Tau蛋白的磷酸化上调有关。

蛋白激酶活化是导致Tau蛋白被异常磷酸化的主要原因，GSK-3β和CDK5是中枢神经系统内磷酸化Tau蛋白的两种主要激酶，且二者在RGC中都有表达，在RGC Tau蛋白磷酸化过程中都发挥重要作用[17-18]。本研究发现，在NMDA刺激的RGC-5内，GSK-3β和CDK5的表达都会增加，而在转染了Reelin抑制物的RGC-5内，GSK-3β的表达增加，转染Reelin类似物后，GSK-3β的表达下降， CDK5在3个转染组中的表达水平无明显变化，提示Reelin在RGC中对Tau磷酸化的抑制作用可能是通过抑制GSK-3β的活性而实现的。

综上所述，Reelin对NMDA 诱导损伤的RGC具有保护作用，这种作用是通过下调GSK-3β表达抑制Tau蛋白磷酸化，进一步抑制细胞凋亡而实现的。