黄连素对人耐紫杉醇去势性前列腺癌细胞凋亡和IL-6/STAT3表达的影响*

张健， 彭煜晖， 李毅， 梁欣明， 付文莉， 张婷， 柏华， 禹文峰， 吴昌学*， 张启芳*

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室 & 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学第三附属医院 医学中心实验室， 贵州 都匀 558000)

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来，中国前列腺癌患者的病死率呈上升趋势[1]。在前列腺癌初期，肿瘤生长具有雄激素依赖性，因此临床上常采用雄激素剥夺治疗[2-3]；但使用此方法治疗2～3年后，前列腺癌可能会发展为转移性去势抵抗性前列腺癌[4]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作为治疗去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)的标准一线化疗药物，其发挥抗肿瘤作用的原因之一是在细胞有丝分裂时可以作用于微管、从而抑制细胞的分裂[5-7]。但是，CRPC患者对PTX产生耐药性后严重降低了其抗肿瘤效果，化学耐药性CRPC是成年男性中最致命的癌症[8]。因此，寻求克服CRPC患者对PTX抗性的有效疗法显得尤为重要。小檗碱(berberine，BBR)是一种常见的季铵生物碱化合物，可以从多种药用植物中分离得到，比如黄连、芸苔科植物等[9-10]。近年的研究表明BBR具有抗肿瘤的活性，包括抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等[11-14]。BBR可通过下调高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)/Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)的表达抑制乳腺癌细胞4T1的增殖及肺部转移[15]，也可通过抑制磷脂酰肌醇激酶-丝苏氨酸蛋白激酶-雷帕霉素靶蛋白信号通路来增强胃癌细胞对顺铂的敏感性[16]。此外，在三阴性乳腺癌中BBR也可通过下调转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFβ1)的表达，从而抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖与迁移[17]。但是，BBR在人耐PTX去势性前列腺癌细胞株DU145R中的作用尚不明确。因此，本研究探讨黄连素对人耐PTX去势性前列腺癌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 人前列腺癌紫杉醇耐药细胞株DU145R为本实验室构建。

1.1.2主要试剂与仪器 胎牛血清和RPMI 1640培养基(美国Gibco)，兔抗白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、兔抗信号转导与转录因子3(signal transducers andactivators of transcription3，STAT3)、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及辣根过氧化物酶标记的抗兔的二抗(美国CST),黄连素(中国大连美仑生物)，十二烷基苯硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶配置试剂盒(中国碧云天)，超敏化学发光试剂盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美国Millipore)，PTX和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美国Sigma)，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qPCR)试剂(上海翊圣)；瞬时离心机D1008E(美国SCILOGEX)，FACS verse型流式细胞仪(美国BD)，2720 Themal cycler PCR仪(美国Applied Biosystem)，Step One Plus Real-time PCR system(美国Applied Biosystem)，GeneGnome XRO NPC 化学发光成像仪(英国SYNGENE)，Varioskan LUX多通道酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific)，Bio-Rda MiniⅡ/Ⅲ垂直电泳仪和Bio-Rda powerpacHC高流电源(美国Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及处理 将人耐PTX前列腺癌细胞株DU145R细胞置于含有10%胎牛血清和1×Antibiotic-Antimycotic的培养基，5%CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.2.2细胞凋亡实验 DMSO(0 μmol/L)BBR、10及20 μmol/L BBR处理对数生长期DU145R细胞72 h，分别为DMSO组(0 μmol/L BBR组)、10 μmol/L BBR组及20 μmol/L BBR组，收集各组细胞并利用Annexin V/PI双染色法凋亡试剂盒检测BBR对DU145R细胞凋亡的影响；按说明书要求上样，流式细胞仪检测；最后利用流式分析软件FlowJo V6分析数据。

1.2.3实时荧光定量PCR DMSO(0 μmol/L BBR)、10及20 μmol/L BBR处理DU145R细胞24 h，分别为0、10及20 μmol/LBBR组，提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒合成cDNA，最后利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，QPCR)检测IL-6和STAT3 mRNA表达水平。qPCR实验反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。IL-6引物∶上游5′-CCAGGAGCCCAGCTATGAAC -3′，下游5′- GATGCCGTCGA-GGATGTACC -3′。STAT3引物∶上游5′-CTGCCT-AGATCGGCTAGAAAAC-3，下游5′-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3′。β-actin引物：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGG-AGAAG-3′，下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGA GTG-3′。最后利用公式2-ΔΔCt计算出STAT3及IL-6 mRNA的相对表达量。

1.2.4蛋白印迹(Western blot)法 收集“1.2.2”项下各组DU145R细胞，提取细胞总蛋白，蛋白上样30 μg，80 V恒压电泳并将目的蛋白转移到PVDF膜上；5%脱脂牛奶室温封闭1 h，室温下分别孵育IL-6一抗(1 ∶1 000)及STAT3一抗(1 ∶1 000)2 h，孵育抗兔二抗(1 ∶1 000)1 h，使用ECL超敏化学发光液检测IL-6和STAT3蛋白表达，利用Image J分析图像强度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞凋亡

流式细胞术结果显示，与DMSO组(0 μmol/L BBR组)相比，10和20 μmol/L BBR组DU145R细胞的凋亡数量均增加(P<0.05)，且具有浓度依赖性。见图1。

注：A、B 分别为流式细胞仪检测结果和DU145R细胞凋亡定量结果； (1)与0 μmol/L BBR组比较，P<0.05；(2)与10 μmol/L BBR组比较，P<0.05。

2.2 IL-6和STAT3 mRNA表达水平

实时荧光定量PCR结果表明，与0 μmol/L BBR组相比，10和20 μmol/L BBR组DU145R细胞中IL-6和STAT3 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05),且具有浓度依赖性。见图2。

注:A、B分别为IL-6和STAT3 mRNA表达；(1)与0 μmol/L BBR组相比，P<0.05;(2)与10 μmol/L BBR组比较，P<0.05。

2.3 IL-6和STAT3蛋白的表达

Western blot结果表明，0 μmol/L组、10及20 μmol/L BBR组DU145R细胞的IL-6和STAT3的蛋白表达水平比较，0 μmol/L BBR组>10 μmol/L BBR组>20 μmol/L BBR组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注:A为IL-6及STAT3蛋白表达；B、C分别为STAT3和IL-6定量结果； (1)与0 μmol/LBBR组比较，P<0.05；(2)与10 μmol/L BBR组比较，P<0.05。

3 讨论

在临床上，CRPC患者对PTX产生耐药性极大的限制了PTX的作用[18]。因此，克服CRPC患者PTX耐药性显得尤为重要。在本研究中，与DMSO组相比，随着BBR浓度的增加，DU145R细胞凋亡数量增加(P<0.05)，表明BBR能够诱导DU145R细胞的凋亡，且具有浓度依赖性。与对照组相比，BBR下调了IL-6/STAT3的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05)，并且具有浓度依赖性，这个结果更进一步的解释的BBR诱导DU145R细胞的凋亡的分子机制。

BBR是黄连的主要活性成分之一，其主要作用是治疗肠道感染[19]。但近年有研究表明，在人肺癌A549细胞中，BBR能够抑制抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表达，同时激活凋亡蛋白Bcl-2关联X蛋白(Bcl2-Assaciated X protein，Bax)的表达，从而诱导A549细胞的凋亡[20]。重要的是BBR也能诱导耐药细胞凋亡，有研究表明，BBR通过激活活性氧/p38丝裂原活化蛋白激酶/半胱天冬酶信号途径促进顺铂耐药黑色素瘤细胞的凋亡[21]。在慢性B淋巴细胞白血病患者中，BBR具有同样的功效，可下调miR-21、Bcl-2及类受体酪氨酸激酶孤儿受体1(receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor 1，ROR1)的表达水平，从而诱导细胞的凋亡[22]。同样，本研究发现BBR也能诱导DU145R细胞的凋亡(P<0.05)，并且具有浓度依赖性。在人前列腺癌细胞株DU145中，IL-6/JAK2/STAT3的激活能显著增强DU145细胞的抗凋亡能力，使用花姜酮处理后DU145细胞后，IL-6/JAK2/STAT3信号途径被显著抑制，从而诱导细胞的凋亡[23]。此外，在肺癌中，STAT3高表达与抗凋亡作用相关，如葛根素抑制STAT3后，A549细胞凋亡显著增加[24]。同样，在前列腺癌中STAT3也与抗凋亡作用相关[25-26]。更为重要的是，在肝癌中下调IL-6的表达能抑制STAT3的表达，从而诱导肝癌细胞LM3的凋亡[27]。此外，有研究报道，在结肠癌的小鼠模型中，BBR能够抑制IL-6的表达，从而改变小鼠结肠癌的恶性病变状态[28]。在乳腺癌细胞MCF-7中，BBR通过抑制JAK2/STAT3的表达，从而诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖[29]。同样的，在人慢性髓系白血病细胞K562中，BBR也能抑制JAK2/STAT3的表达，从而抑制K562细胞的凋亡[30]。与预期一致，在本研究中，BBR能够诱导DU145R细胞凋亡，而且还能够抑制DU145R细胞IL-6及STAT3的mRNA表达水平与蛋白表达水平(P<0.05)。

综上所述，BBR可通过下调IL-6/STAT3的表达来诱导DU145R细胞的凋亡。本研究未进行体外验证，没有进一步探讨BBR是否能增加DU145R细胞对PTX的敏感性，因此在后续工作中将继续验证本研究的假设。