异丙肾上腺素诱导的慢性应激焦虑样行为学检测

张 影，鲁艳杰，刘 莹，许 倩，刘 镭，左彦珍，李玉红

（承德医学院，河北承德 067000）

随着生物医学模式向生物-心理-社会医学模式的转变，心理应激在疾病发生发展过程中的影响引起了越来越多的关注。慢性应激是一种包括焦虑、抑郁、绝望等长期的负面情绪，此时机体的内分泌系统出现紊乱，其中包括交感神经系统（sympathetic nervous system, SNS）和下丘脑—垂体—肾上腺轴（the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA），SNS和HPA轴被激活后，所释放的儿茶酚胺类激素是重要的应激反应激素，主要包括肾上腺素和去甲肾上腺素等[1-6]，这些激素作用于肾上腺素能α和β受体。近十年的研究发现，慢性应激参与各种生理心理疾病的过程，包括肿瘤的发生发展[7-10]、DNA损伤[11]及其对大脑神经元[12]的影响。在临床上，慢性心理应激现象普遍存在，主要是因为患者在接受治疗的过程中会产生一系列身体上的不适，在这种长期的压力刺激下，患者容易产生以焦虑、抑郁为主的慢性应激情绪[13]，处于慢性应激状态的患者会出现病情加重、生活质量水平降低，甚至生存期缩短的现象。但是仅对出现慢性应激焦虑情绪的患者实施护理教育等一般性心理支持，未能取得显著效果。

慢性应激动物模型最早的建立方法是由Thaker等[14]通过慢性应激诱导建立的卵巢癌动物模型，经过多年的探索，Willner[15]改良的慢性不可预见性刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）试验的方法被广泛接受，但是该试验方法操作难度较大，而且呈现出多样化，方案的选择与实验强度的规定没有统一标准[16]。因此，慢性应激动物模型的建立方法尚不存在一种规范的方法，导致大多数实验局限在细胞水平。

β受体的激活与慢性应激密切相关，利用外源性的儿茶酚胺类药物异丙肾上腺素诱导小鼠慢性应激焦虑模型的方法具有可行性。本次实验以CUMS实验方法作为阳性对照组，异丙肾上腺素的长期诱导作为试验方案，旨在为慢性应激焦虑模型的构建提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性昆明小鼠（昆明小鼠）50只，体质量25～30g，购自北京华阜康生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2019-0008。SPF级饲养，昼夜节律12/12h，动物定时给予食物和饮水（慢性应激处理组除外）。

1.1.2 分组和模型制备 随机对照动物实验，昆明小鼠饲养1周适应环境后，将50只昆明小鼠随机分成对照组、慢性应激组、ISO组、慢性应激+ICI组、ISO+ICI组，每组10只。

1.1.3 实验药物及仪器 盐酸异丙肾上腺素注射液ISO（上海禾丰制药有限公司，中国）；ICI 118，551（Sigma，美国）；高架十字迷宫（型号：XR-XG201）；明暗箱（型号：XRXB120）；均购自上海欣欣信息科技有限公司，采用配套行为学软件进行记录。

1.2 实验方法

50只昆明小鼠，随机分为对照组、慢性应激组、β-AR激动剂异丙肾上腺素（isoprenaline, ISO）组、慢性应激+选择性β2-AR阻滞剂ICI 118，551（ICI）处理组、β-AR激动剂异丙肾上腺素+选择性β2-AR阻滞剂ICI 118，551（ISO+ICI）处理组，共5组，每组10只。对照组：正常饲养，每天腹腔注射生理盐水；慢性应激组：每天进行慢性应激处理；ISO处理组：利用β-AR激动剂异丙肾上腺素每天腹腔注射ISO（5mg/kg）；慢性应激+ICI处理组：每天慢性应激处理后腹腔注射ICI（0.2mg/kg）；ISO+ICI处理组每天腹腔注射给药ISO（5mg/kg）和ICI（0.2mg/kg）。

慢性应激处理方法:每天交替进行通过禁食24h、禁水24h、黑暗刺激24h、光照刺激24h、猫叫声（猫叫模拟软件）刺激5min、冰上刺激1min、37℃水循环刺激5min、潮湿环境24h和倒立5min。

高架十字迷宫实验：实验开始时，将昆明小鼠放于面对开放臂放至迷宫的中心区，摄像系统记录下昆明小鼠5min运动轨迹视频，指标选择：开臂停留时间、闭臂停留时间、停留总时间及开臂停留时间百分比；进入开臂次数、进入闭臂次数、总次数和进入开臂次数百分比；判断标准以昆明小鼠重心进入到臂内为准，重心从该臂中退出为该次进入活动完成。

开臂停留时间百分比=开臂停留时间/（开臂停留时间+闭臂停留时间）×100%；进入开臂次数百分比=进入开臂次数/（进入开臂次数+进入闭臂次数）×100%。

明暗箱实验：实验开始时，将昆明小鼠放于明箱，摄像系统记录下昆明小鼠5min运动轨迹视频。指标选择：明箱停留时间、暗箱停留时间、明箱停留时间百分比、明箱活动次数、暗箱活动次数、穿梭总次数，选用动态背景法监测小鼠动态，每只小鼠实验完成后均用75%酒精消毒以消除前一只小鼠的气味。

1.3 统计学处理方法

所有研究数据均应用采用SPSS 21.0软件进行统计分析。正态分布数据比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验结果表明，慢性应激组和ISO组昆明小鼠的行为学结果表现出一致性，慢性应激+ICI组和ISO+ICI组与对照组小鼠表现出一致性。在现象上表明β-AR激动剂异丙肾上腺素可诱导昆明小鼠出现慢性应激焦虑样行为，而特异性β2受体阻滞剂ICI阻止了这一变化。

2.1 高架十字迷宫各臂停留时间结果

开臂停留时间和开放臂停留时间比例：慢性应激组和ISO组小鼠均显著小于对照组（P<0.05），慢性应激+ICI组和ISO+ICI组与对照组昆明小鼠比较，差异无统计学意义（P>0.05）；闭臂停留时间：慢性应激组和ISO组小鼠均显著高于对照组（P<0.05），慢性应激+ICI组和ISO+ICI组与对照组昆明小鼠比较，差异无统计学意义（P>0.05）；停留总时间：各组间差异无统计学意义。如图1：

图1 高架十字迷宫中昆明小鼠各臂停留时间

2.2 高架十字迷宫各臂进入次数结果

进入开臂次数和进入开臂次数百分比：慢性应激组和ISO组小鼠均显著小于对照组（P<0.05），慢性应激+ICI组和ISO+ICI组与对照组昆明小鼠比较，差异无统计学意义（P>0.05）；进入闭臂次数：慢性应激组和ISO组小鼠均显著高于对照组（P<0.05），慢性应激+ICI组和ISO+ICI组与对照组昆明小鼠比较，差异无统计学意义（P>0.05）；进入总次数：各组间差异无统计学意义。如图2：

图2 高架十字迷宫中昆明小鼠各臂进入次数

2.3 明暗箱停留时间结果

慢性应激组和ISO组昆明小鼠的明箱停留时间、明箱停留时间百分比均低于对照组昆明小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）；暗箱停留时间高于对照组昆明小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。慢性应激+ICI组和ISO+ICI组昆明小鼠的明箱停留时间、暗箱停留时间、明箱停留时间百分比与对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05）。如图3：

图3 昆明小鼠明暗箱停留时间

2.4 明暗箱活动次数结果

慢性应激组和ISO组昆明小鼠的明箱活动次数和 穿梭次数均低于对照组昆明小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）；暗箱进入次数与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。慢性应激+ICI组和ISO+ICI组昆明小鼠的明箱活动次数、暗箱活动次数和穿梭次数与对照组相比差异均无统计学意义（P>0.05)。如图4：

图4 昆明小鼠明暗箱进入次数

3 讨论

应激反应可分为急性应激和慢性应激，在长期慢性应激刺激下，儿茶酚胺类激素的表达量增高，焦虑症、抑郁症等发病率增高，同时也会诱发很多疾病的发生，包括肿瘤的发生、发展等[17-20]。现如今，对慢性应激模型动物的行为学分析是判断动物模型建立是否成功的主要手段，高架十字迷宫和明暗箱实验是动物慢性应激焦虑样行为研究中较为经典与成熟的测试方法[21-24]。目前较公认的慢性应激模型多为Willner改良的CUMS试验，但该方法并没有一种规范的实验方案，加上在实际操作过程中的工作量较大，有时需要特殊仪器设备，并且在造模过程中容易造成动物的物理损伤，方法仍不成熟。到目前为止，β2受体与慢性应激关系的实验多数为细胞实验。

异丙肾上腺素是常见的临床用药，是一种人工合成的药物，对于β1和β2受体均具有强大的激动作用。因此，本实验使用外源性异丙肾上腺素模拟慢性压力状态时儿茶酚胺类激素的释放，对昆明小鼠进行长期刺激。结果表明，慢性应激小鼠更易表现为焦虑样行为，在高架十字迷宫实验中表现为开臂停留时间、进入开臂次数、开臂停留时间百分比和进入开臂次数百分比均显著减少，与本次行为学结果相符合；在明暗箱实验中，慢性应激模型小鼠明箱停留时间、明箱停留时间百分比、明箱活动次数显著和穿梭次数显著减少，暗箱停留时间显著高，暗箱进入次数与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），表明异丙肾上腺素药物诱导组与慢性压力刺激组出现一致的行为，即异丙肾上腺素能够模拟慢性压力刺激建立慢性应激小鼠模型。用β2受体阻滞剂ICI处理的慢性应激的昆明小鼠都表现出与对照组一致的行为方式，高架十字迷宫实验中慢性应激+ICI组和ISO+ICI组昆明小鼠的开臂停留时间、进入开臂次数、开臂停留时间百分比、进入开臂次数百分比、进入闭臂次数和进入各臂总次数与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）；明暗箱实验中慢性应激+ICI组和ISO+ICI组昆明小鼠的明箱停留时间、暗箱停留时间、明箱停留时间百分比、明箱活动次数、暗箱活动次数和穿梭次数与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05），此结果表明，特异性β2受体阻滞剂ICI可抑制慢性应激小鼠出现焦虑样行为，显示异丙肾上腺素可能是通过β2受体发挥作用，但其具体机制需要进一步实验进行完善。

本次实验符合良好慢性应激模型特征[25]，体现出了动物模型行为表现的模拟性（慢性应激组和ISO处理组一致的行为学结果），同时也具有一定的理论合理性（造模手段与慢性应激和β2受体相关）。考虑到β2特异性受体激动剂易导致心悸、骨骼肌震颤等不良反应明显的副作用，长期、单一应用β2受体激动剂可造成β2受体的下调，易出现耐药现象[26]，以及前期无β2特异性受体激动剂动物用药的参考，本次实验未选β2特异性受体激动剂进行实验。

综上所述，CUMS建立慢性应激模型存在一定的不足，本次实验通过长期使用异丙肾上腺素诱导昆明小鼠，使其行为学表现与慢性应激组一致，说明异丙肾上腺素有望成为构建慢性应激动物模型的有效药物，为后续的临床和基础实验提供了一种新的慢性应激焦虑模型的构建思路。