查耳酮衍生物L2H24对H2O2诱导损伤的心肌细胞的保护作用

胡琳雅，洪承吕，陈潜，何文斐，吴建章

1.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 心血管内科，浙江 温州 325015

研究表明，氧化应激是多种心血管疾病的重要病理机制，外界刺激诱使机体中产生过量的ROS，介导组织和细胞中脂质、DNA和蛋白质氧化损伤，进而导致强烈的炎症反应和细胞死亡（焦亡、凋亡和坏死）[1-3]。而心脏作为高能量需求器官，极易受到氧化损伤[4]。

查耳酮类化合物是一类低毒的药食同源的天然产物，具有抗氧化[5]、抗炎[6]、抗肿瘤[7]和抗真菌[8]等广泛的生物活性。本课题组前期研究发现查耳酮衍生物L2H24能通过抗氧化和抗炎作用改善脑缺血再灌注损伤和急性肺损伤[9-10]，而L2H24能否在氧化应激相关的心肌细胞损伤中发挥保护作用及其分子机制尚未可知。本研究探讨了L2H24对大鼠心肌细胞H9c2的保护作用，旨在阐明其对H2O2刺激所致细胞氧化应激和焦亡的影响及潜在的分子机制，以期为心肌氧化损伤的治疗提供新的候选抗氧化剂。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究所用化合物L2H24由本课题组的化学实验室合成，结构见图1[9]。大鼠心肌细胞H9c2购于中国科学院，DMEM（1 g/L）培养基、胎牛血清、0.25%含EDTA胰酶、PBS缓冲液、双抗（10 000 U/mL） 购于美国Gibco公司，MTT噻唑蓝购于北京索莱宝生物科技有限公司，结晶紫染色液、MDA检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒购于上海碧云天生物技术公司，多聚甲醛、TBHQ（食品抗氧化剂）、30% H2O2购于上海阿拉丁试剂有限公司，一抗HO-1、Nrf2、IL-1β购自美国Santa公司，β-actin、GAPDH购于武汉三鹰生物技术有限公司，Caspase-1、抗兔、抗鼠二抗购于美国CST公司，Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司，小干扰RNA（si-Nrf2）序列购于上海吉玛制药技术有限公司，CO2恒温培养箱购于美国Thermo公司，倒置荧光显微镜购于日本Nikon公司，酶标仪、ChemiDocTMXRS+凝胶成像仪器购于美国Bio-Rad公司。

图1 L2H24的分子结构

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：H9c2细胞用DMEM（1 g/L）基础培养基加10%的胎牛血清、1%的双抗的完全培养基培养。约2～3 d消化传代1次，传代后约留30%的细胞用于继续培养。

1.2.2 造模损伤H2O2浓度的确定：取处于对数生长期的H9c2细胞，3 000个/孔铺96孔板，37 ℃恒温培养箱中贴壁过夜。用终浓度为100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2孵育细胞24 h后，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，4 h后吸走96孔板中的液体，重新加入DMSO 120 μL/孔，并置于微型振荡器上混匀。待紫色晶体全部溶解，用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定其吸光度（A）值，计算细胞生存率（实验组A值/对照组A值×100%）。

1.2.3 MTT实验：取处于对数生长期的H9c2细胞，3 000个/孔铺96孔板，37 ℃恒温培养箱中贴壁过夜（24 h），L2H24以不同浓度（0.3125、0.625、1.25、2.5、5 μmol/L）预孵育18 h后，加H2O2刺激，24 h后MTT法测细胞存活率。

1.2.4 集落克隆实验：取处于对数生长期的H9c2细胞，2 000个/孔铺12孔板，于37 ℃恒温培养箱贴壁培养过夜（24 h），先加不同浓度的L2H24预孵育18 h，再加H2O2共同孵育。7 d后，弃去板内原有细胞培养基，用4%多聚甲醛室温下固定细胞20 min， PBS缓冲液洗两次，再用结晶紫染色30 min（可适当延长），用PBS清洗后晾干、拍照。

1.2.5 MDA含量测定：H9c2细胞20万/孔铺6孔板，置于37 ℃恒温培养箱中贴壁培养过夜（24 h），先加5 μmol/L的L2H24、TBHQ各自预孵育18 h，再加H2O2刺激，2 h后收蛋白检测MDA含量，实验过程严格按照说明书进行。

1.2.6 细胞焦亡拍片：取处于对数生长期的H9c2细胞，2 000个/孔铺96孔板，于37 ℃恒温培养箱贴壁培养过夜（24 h），先加L2H24预孵育18 h，再加H2O2刺激，24 h后倒置荧光显微镜下观察细胞形态改变。

1.2.7 Western blot检测：H9c2细胞30万/孔铺6孔板，置于37 ℃恒温培养箱中过夜培养（24 h），加不同浓度的药物孵育18 h后收蛋白或者先加药物预孵育18 h，再加H2O2刺激24 h后收蛋白。细胞总蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，用SDS-PAGE分离蛋白样品（80 μg），然后转移到PVDF膜上。PVDF膜用5%的脱脂牛奶在室温下封闭1 h，后一抗4 ℃孵过夜（HO-1 1:500；β-actin 1:2 000；Caspase-1 1:1 000；IL-1β 1:1 000）。次日，用TBST室温下在摇床上洗3次，后二抗孵60 min。蛋白条带由ChemiDoc XRS+系统成像，ImageJ软件定量。

1.2.8 细胞中核、浆Nrf2蛋白的检测：细胞铺板及加药：大鼠心肌H9c2细胞30万/孔铺6孔板，37 ℃ 恒温培养箱中贴壁过夜，加DMSO、L2H24孵育6 h后收蛋白。细胞核蛋白与细胞浆蛋白的提取：按浆蛋白提取试剂A:磷酸酶抑制剂为100:1的比例预先配制好蛋白裂解液并于冰上预冷，弃去6孔板中原有细胞培养基，加入PBS清洗干净后，加入裂解液于冰上裂解10 min。用细胞刮刀刮下细胞蛋白并收集于1.5 mL的EP管中。将收完的蛋白在涡旋仪上涡旋 15 s，冰上静置1 min。按说明书用量加入浆蛋白提取试剂B，涡旋5 s，冰上静置1 min，重复两次。以上蛋白样品在高速离心机中以12 000×g离心 5 min。小心吸取上清液（即为浆蛋白），装入新的EP管中备用。剩余沉淀，完全吸尽残余的上清液，加入添加了磷酸酶抑制剂的细胞核蛋白抽提试剂，涡旋15 s，冰上静置15 min，重复2次。之后，4 ℃ 12 000～16 000×g离心10 min。立即吸取上清液至一预冷的EP管中，即为抽提得到的细胞核蛋白，可以-70 ℃冻存备用。后以Western blot法检测相关蛋白，一抗稀释度：Nrf2 1:500，PCNA 1:1 000，GAPDH 1:2 000。

1.2.9 小干扰RNA沉默实验：以Nrf2为靶点的si-RNA序列是由上海吉玛制药技术有限公司设计并化学合成，nrf2-rat-1482的序列为sense（5’-3’）GGAGAGGGAAGAAUAAAGUTT，antisense（5’-3’）ACUUU AUUCUUCCCUCUCCTT。将大鼠心肌H9c2细胞以80万/皿 铺中皿，待细胞贴壁后加入按照说明书配制好的nrf2-rat-1482或Negtive Control序列（6 μL/mL，2 mL体系），用Lipofectamine 2000于饥饿培养基中转染12 h，之后换为正常培养基，继续培养12 h后收集细胞，进行后续实验，剩余细胞继续培养 48 h后收蛋白检测Nrf2-si-RNA干扰效果。

1.3 统计学处理方法 使用SPSS22.0统计软件进行分析。每个实验重复3次以上，数据以表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2损伤对H9c2心肌细胞存活率的影响 不同浓度的H2O2（100、200、300、400、500、600 μmol/L） 刺激H9c2细胞24 h后，细胞存活率随着H2O2浓度的增加而不断降低，呈现浓度依赖性。H2O2抑制细胞活力的IC50约为500 μmol/L。因此，后续实验均选择500 μmol/L浓度的H2O2构建心肌氧化损伤细胞模型。见图2。

图2 不同浓度H2O2刺激对H9c2细胞存活率的影响

2.2 H2O2介导H9c2细胞的氧化损伤 与对照组比，H2O2损伤降低了H9c2细胞在极低密度时的增殖能力，严重抑制了细胞的集落形成。MDA是由ROS引起的多不饱和脂肪酸过氧化的副产物，是氧化应激的重要生物标志物[11]。与对照组（100%）相比，H2O2处理2 h后，H2O2损伤模型组细胞中的MDA含量（234.0± 10.4）%明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。过量产生的ROS会促使细胞发生焦亡[12]。在H2O2损伤模型组中观察到大量焦亡细胞肿胀膨大，并且有许多气泡状突出物。见图3。

图3 H2O2对H9c2心肌细胞氧化损伤和焦亡的影响

2.3 L2H24对H2O2诱导氧化损伤的H9c2细胞具有保护作用 与对照组比，H2O2组细胞存活率约为50%，用L2H24预孵育18 h后，氧化损伤的H9c2心肌细胞的存活率增加（P＜0.05），且随着剂量的增加，存活率显著升高，5 μmol/L浓度的L2H24对心肌细胞的保护作用明显优于相同浓度的阳性对照药TBHQ。集落克隆实验结果表明，H2O2损伤抑制了心肌细胞的克隆形成能力，而L2H24预孵育18 h可逆转上述情况。与对照组比，H2O2组细胞中的MDA含量明显升高，而用L2H24预孵育18 h后，氧化损伤的心肌细胞中的MDA含量明显降低（P＜0.05），且其降低MDA的能力明显优于阳性对照药TBHQ。见图4。

图4 L2H24对H2O2诱导的氧化损伤的H9c2细胞的保护作用

2.4 L2H24改善H2O2诱导的H9c2心肌细胞焦亡 L2H24预孵育18 h后，H2O2诱导的细胞焦亡现象得到改善。Western blot及其定量结果显示，与对照组比，H2O2损伤组细胞中焦亡相关蛋白Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表达均增加（P＜ 0.05）。经L2H24处理后，细胞中Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表达降低（P＜0.05）。见图5。

图5 L2H24改善H2O2诱导的H9c2心肌细胞焦亡

2.5 L2H24促进Nrf2易位入核并增加其下游抗氧化蛋白HO-1的表达 氧化损伤相关蛋白检测结果显示，与对照组相比，L2H24给药组细胞核中的Nrf2表达水平显著上调，而胞浆中Nrf2蛋白表达水平则明显降低（P＜0.05），即L2H24能促进Nrf2易位入核。进一步研究发现，L2H24能上调H9c2细胞中Nrf2下游抗氧化蛋白HO-1的表达水平。与DMSO组相比，L2H24以较低浓度（1.25 μmol/L）孵育细胞就能显著上调细胞中的抗氧化蛋白HO-1的表达（P＜0.05），并且药物浓度越高，HO-1蛋白表达水平随之升高。见图6。

图6 L2H24促进H9c2细胞中Nrf2易位入核并增加其下游抗氧化蛋白HO-1的表达

2.6 干扰Nrf2的表达抑制了L2H24对H2O2诱导氧化受损心肌细胞的保护作用 运用Nrf2-si-RNA转染细胞后，心肌细胞中Nrf2表达水平显著下调（P＜0.05）。实验结果显示，L2H24可明显提高对照si-RNA组（NC）中氧化受损细胞的存活率（P＜0.05），促进NC组中H2O2损伤细胞的集落形成，降低细胞中脂质过氧化水平（P＜0.05），改善心肌细胞焦亡，而在si-Nrf2组细胞中，L2H24并未显现出相同的细胞保护活性。见图7。

图7 干扰Nrf2的表达抑制了L2H24对氧化受损心肌细胞的保护作用

3 讨论

查耳酮类化合物广泛分布于蔬菜、水果、茶叶和其他植物中[13]，近年来，因其具多样的生物活性如抗菌、抗癌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗溃疡等而引起人们的广泛关注[14]。报道显示，查耳酮类化合物在高血压、心律失常、心肌梗死和心力衰竭等多种心血管疾病的治疗中发挥重要作用[15]。已有研究发现某些查耳酮类化合物可通过调节氧化应激水平来减轻心肌组织损伤，如天然抗氧化剂异甘草素能通过激活AMPK/ERK信号通路改善缺氧心肌细胞的收缩功能障碍[16]，还能通过抑制高血糖诱导的炎症反应和氧化应激减轻糖尿病性心肌病[17]；玉郎伞查耳酮能通过激活JAK2/STAT3通路减轻大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤[18]；Aza白藜芦醇-查耳酮衍生物6b通过减轻炎症和氧化应激改善小鼠糖尿病性心肌病[19]。基于以上报道，本研究旨在探讨查耳酮衍生物L2H24在氧化应激相关的心肌细胞损伤中的保护作用及其分子机制。

H2O2作为一种内源性细胞信号分子，可以在较短时间内诱导产生自由基，氧化DNA、蛋白质和核酸，最终导致细胞死亡，被广泛应用于细胞氧化损伤模型中[20]。本研究采用H2O2刺激大鼠心肌H9c2细胞建立心肌氧化应激损伤模型来模拟体内氧化应激病理过程，发现500 μmol/L浓度的H2O2严重抑制了H9c2细胞的集落形成，显著上调了细胞氧化损伤后产生的脂质过氧化物MDA的水平。查耳酮衍生物L2H24能够呈剂量依赖性地增加H2O2损伤的H9c2细胞的存活率，促进细胞集落形成，同时显著减少细胞中MDA的水平，对氧化损伤的心肌细胞具有良好的保护作用。

细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡，又称细胞炎性坏死，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致大量促炎因子释放进而激活强烈的炎症反应[21]。促炎Caspase亚家族中的Caspase-1可通过激活典型的炎症小体途径，介导焦亡的发生[22]。Caspase-1又被称为IL-1β的加工酶，能介导产生成熟的IL-1β，这是一种重要的促炎细胞因子，参与多种人类疾病进程[23-24]。本研究发现，H2O2刺激能诱导心肌H9c2细胞产生氧化应激损伤，导致细胞肿胀膨大，并产生有许多气泡状突出物，发生严重的细胞焦亡现象，而查耳酮衍生物L2H24能够明显改善氧化损伤细胞的焦亡现象。进一步研究发现，L2H24能够抑制H2O2诱导的Caspase-1/IL-1β活化。

核因子相关因子2，又称NFE2L2或Nrf2，是调节抗氧化系统和细胞保护基因的关键分子[25-26]。Nrf2在肝脏、心脏、大脑、肾脏、血管和肌肉等多种耗氧器官中均有表达[27]。正常情况下Nrf2的表达仅限于细胞质，并以非活性形式存在。内源性抑制剂Keap1与Nrf2的相互作用促进了Nrf2的蛋白酶体降解[28]。然而，在氧化应激条件下，产生的ROS破坏了Keap1与Nrf2的相互作用，Nrf2被释放入细胞核，并与ARE结合，激活其下游基因的转录，进而翻译出一系列相关蛋白，发挥生理功能[29]，HO-1就是其下游一个重要的抗氧化蛋白[30]，故L2H24是否通过影响Nrf2/HO-1信号通路对H2O2诱导的H9c2细胞起保护作用值得被探讨。本研究结果表明，L2H24能促进Nrf2易位入核并显著上调H9c2细胞中其下游抗氧化的HO-1蛋白的表达水平。为了进一步确证化合物L2H24是否通过靶向Nrf2信号通路对H2O2诱导氧化损伤的心肌细胞起保护作用，我们运用小分子RNA技术干扰了H9c2细胞中Nrf2的表达，结果显示，沉默Nrf2抑制了L2H24对H2O2氧化损伤细胞的保护作用，说明L2H24可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，从而对H2O2诱导氧化损伤的心肌H9c2细胞起到保护作用。

新近研究发现，氧化应激与细胞焦亡的发生息息相关，过量ROS可激活NLRP3炎症小体并参与细胞焦亡途径[12]，铁激活的ROS通过ROS-Tom20-Caspase-3-GSDME信号通路诱导黑色素瘤细胞焦 亡[31]，线粒体ROS通过诱导GSDMD氧化促使巨噬细胞焦亡[32]。本研究发现，小分子RNA技术干扰Nrf2的表达抑制了L2H24对H2O2诱导心肌细胞焦亡的保护作用，侧面证实了氧化应激与细胞焦亡的发生有关，这与文献调研结果一致。研究结果表明，L2H24可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，从而对H2O2诱导的心肌H9c2细胞焦亡起到保护作用。

综上所述，L2H24对H2O2诱导损伤的心肌细胞具有良好的保护作用，其可能是通过激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路来改善细胞氧化应激及焦亡。本研究初步证明了L2H24对H2O2诱导氧化损伤的心肌细胞的抗氧化和抗焦亡保护作用及其相关分子机制，为心肌氧化损伤的治疗提供新的候选抗氧化剂。