腺苷-3’, 5’-环磷酸-氧蒽酮希夫碱的合成及其与LC3B的绑定结合

周超群，汤石鹏，钱亮亮，甄政安，程如梅

温州医科大学 眼视光学院（生物医学工程学院） 纳米生物材料研究所，浙江 温州 325027

正确的蛋白折叠形态是维持细胞与组织稳定生化过程的基础[1]。基因突变、应激以及不良的翻译后修饰常常导致蛋白错误折叠[2]。错误折叠蛋白的堆积易引发一系列疾病，例如阿尔茨海默病、亨廷顿病、白内障等[3]。最近，科学家尝试利用自噬标志物微管相关蛋白1轻链3（LC3）作为靶标，设计引导型药物分子，识别并诱导致病的错误折叠蛋白定位到自噬体膜上，利用自噬降解相关致病蛋白，保留结构相近的功能性蛋白，达到治疗目的，取得了理想的结果[4]。

本研究将氧蒽酮与腺苷-3’，5’-环磷酸反应，得到腺苷-3’，5’-环磷酸-氧蒽酮希夫碱（S1），研究其与自噬标志物LC3B的作用，得到二者的结合模式和稳定常数，从分子水平上揭示如何通过LC3B的作用来开发诱导自噬的潜在药物。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 氧蒽酮、腺苷-3’，5’-环磷酸、三乙胺、磷酸系PBS缓冲溶液、乙醇，均由国药集团上海试剂公司提供。重组人LC3B蛋白（ab103506）购自艾博抗（上海）贸易有限公司。LC3B溶液使用时新鲜配制。所有溶液均用去离子水配制。

1.2 实验仪器 紫外可见分光光度计（Lamda 35，美国Perkin Elmer公司），荧光光谱仪（AB-series 2 luminescence spectrometer，日本Hitachi High-Technologies公司），元素分析仪（Vario EL III型，德国Elmentar公司）。

1.3 S1的合成 将0.1961 g（1 mmol）氧蒽酮溶解于20 mL无水乙醇中，加入0.3292 g（1 mmol）腺苷-3’，5’-环磷酸和0.3 mL冰醋酸，加热回流450 min，冷到室温，过滤，收集浅黄色沉淀，分别用水、乙醇、无水乙醚洗涤多次。真空干燥。产率：73%。元素分析：计算值C22H18N5O7P，C 53.34%，H 3.66%，N 14.14%，O 22.61%；测试值：C 53.32%，H 3.86%，N 14.11%，O 22.63%。

1.4 光谱测试 所有测试均在pH 7.4的PBS缓冲溶液中进行，使用时将LC3B新鲜配成浓度为1× 10-4mol/L工作溶液；测试前将LC3B溶液和S1溶液混合后放置160 s，再进行紫外-可见光谱或者荧光光谱测定。反应动力学测定，将LC3B溶液和S1溶液调成所需要的浓度，混合后，间隔一定时间测定 352 nm附近的紫外-可见光谱变化。

2 结果

2.1 LC3B与S1作用的动力学 图1为浓度 2.0×10-5mol/L的S1与LC3B作用160 s后的紫外-可见光谱图。由图1可见，S1有三个典型的谱峰，分别在239、260、341 nm处。位于大约270 nm处的一个弱而宽的峰，归属于LC3B芳基氨基酸残基的弱的n-π*吸收峰。将浓度相同的S1和LC3B溶液混合，每隔一段时间对体系进行扫描，所得的紫外-可见光谱图见图2。从图可知，在刚开始时S1的紫外-可见光谱处于最上端，加入LC3B后吸光度下降。在160 s之内，随时间的推移，光谱逐步从341 nm红移，最后稳定在350 nm，吸收强度缓慢下降。

图1 S1和LC3B相互作用的紫外-可见光谱图

图2 S1和LC3B随时间变化的紫外-可见光谱图（S1和LC3B浓度均为1.0× 10-5 mol/L）

由一级反应动力学方程和朗伯比尔定律[5]，得

式中A0、A分别为S1全部处于自由状态下的吸光度和S1与LC3B完全结合后的吸光度（这里取波长为352 nm处的吸光度），At为时刻t时的吸光度，k是反应速率常数。通过ln(A-A0)对t作图，可以得到S1与LC3B结合后的反应速率常数（见图3、表1）。

表1 LC3B与S1不同比例的反应动力学参数

图3 不同[LC3B]/[S1]比例的反应动力学关系图

2.2 LC3B与S1作用的热力学研究 图4显示在239 nm 激发下，LC3B在278 nm处有一个很宽的荧光峰，而S1在315 nm发出较强的荧光，覆盖了大部分的LC3B谱峰。S1荧光峰随着LC3B浓度变化（见图5）的测定结果表明随着LC3B浓度的增大，S1在315 nm处的荧光峰并没有成比例提高，反而呈现出下降趋势。

图4 S1和LC3B溶液的荧光光谱

图5 LC3B对S1的荧光滴定图

从分子相互碰撞能量转移的角度研究，当荧光体与猝灭剂由于热运动发生碰撞时，可引起荧光体的荧光猝灭。这种碰撞猝灭服从Stern-Volmer方 程[6]：

其中F0是自由的S1的荧光强度，F是加入LC3B后的荧光强度，C为LC3B的浓度，Ksv为Stern-Volmer荧光猝灭常数。从图6和表2看，S1和LC3B作用符合Stern-Volmer方程。在这样的情况下，碰撞分子形成复合物的结合常数K和位点数n与荧光强度存在以下关系：

图6 不同温度下的Stern-Volmer线性图

综合Stern-Volmer方程关系，得到表2的Stern-Volmer方程和分子复合物参数。

表2 LC3B滴定S1的荧光特征参数

由表2所得到的S1和LC3B结合常数K可以进一步计算出S1和LC3B结合的热力学参数ΔH、ΔS和ΔG：

式中ΔG、ΔH、ΔS分别为吉布斯自由能、焓变及熵变。其结果列于表3。

表3 S1结合到LC3B上的热力学参数

3 讨论

药物分子与蛋白质分子的相互作用包括静电力、氢键、疏水作用力和范德华力。不同类别的作用力将会影响药物分子与蛋白质结合、药物代谢、转运等过程。为此，本研究从分子动力学和热力学角度去探讨与自噬相关的LC3B靶向化合物的作用模式。由图1紫外-可见光谱可知，S1在239和260 nm处显示出两处典型的共轭环π-π*跃迁峰，290 nm的宽的肩峰为杂环的n-π*吸收峰，而希夫碱的C=N强烈的n-π*则出现在341 nm处。LC3B只显示很弱的芳基氨基酸残基的n-π*吸收峰。通过时间变化观察LC3B与S1的变化过程，发现随着时间的增加S1的C=N吸收峰下降，并逐步红移，最后平衡在352 nm。说明S1与LC3B作用有一个缓慢的滞后期，时间为 4 min，希夫碱就与LC3B发生了强烈的作用。且当S1作用于LC3B时，LC3B在反映蛋白质螺旋结构的210 nm处吸光度有所下降，显示出S1有嵌插进入LC3B主链的情况，螺旋结构稍微变松散[7]。改变S1和LC3B浓度比，可以发现所得的反应速率常数基 本维持不变，符合准一级反应和药物的定比转运规律[8]。

荧光光谱表明随着LC3B的加入，S1位于315 nm的荧光发射峰缓慢下降，而该峰与S1分子中的C=N双键和几乎共平面的氧蒽酮三环共轭结构相关[9]， 表明S1和LC3B的相互作用的确发生在希夫碱的碳氮双键上，与紫外-可见光谱的结果一致。S1和LC3B作用符合Stern-Volmer方程，随着温度的升高，斜率下降，表明温度的升高，分子运动增强，并没有引起荧光猝灭的增强，体系不是动态猝灭，为静态猝灭，二者形成了复合物。且在不同实验温度下，Stern-Volmer方程具有良好的线性关系，说明复合物只有一种结合模式。通过方程（3）计算得到S1和LC3B的结合位点数为1。热力学结果表明，吉布斯自由能ΔG＜0，S1和LC3B的结合为一个自发的过程。而研究[10]表明，当ΔH＜0、ΔS＞0，药物分子与蛋白质之间主要是疏水作用，当ΔH＜0、ΔS＜0时为典型的氢键和范德华力结合，而当ΔH接近0、ΔS＞0或者当ΔH＜0，忽略ΔS的情况下，主要为静电作用。结合前述光谱研究和表3，可以发现S1和LC3B的作用力主要为静电作用，这种静电力，影响了C=N上的电子共轭，从而导致荧光猝灭。

综上所述，本研究合成得到了一种具有LC3B结合绑定功能的腺苷-3’，5’-环磷酸-氧蒽酮希夫碱，其与LC3B的结合满足准一级动力学方程和药物分子的定比转运规律。分子热力学研究表明二者的结合为静电作用的结果，S1与LC3B以一种复合物的结合模式存在，结合位点数为1。