12个候选单核苷酸多态性位点与中国儿童急性淋巴细胞白血病易感性和预后的关系

王桢，吴蕊池，莫一啸，陈静，汤燕静，沈树红，

1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 儿童血液科，浙江 温州 325027；2.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 血液肿瘤科，上海 200127

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤[1-3]，且发病率呈逐年上升趋势。近年来基于危险度分层及危险度调整的个体化治疗方案使得儿童ALL的治疗取得了显著改善，在发达国家，总生存率（overall survival rate，OS）达90%，长期无事件生存率（event-free survival rate，EFS）达80%[4]。上海儿童医学中心（SCMC）一项研究显示ALL患儿OS达80%，长期EFS达64.6%[5]，但仍有相当多的患儿在治疗期间经历复发、死亡、耐药、第二肿瘤等。

ALL发病是多种环境和遗传因素相互作用的结果[6]。近年来全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）表明，胚系单核苷酸多态性可能影响儿童ALL的易感性，有21个SNP位点和儿童ALL易感性相关[7-8]。有研究对部分位点进行了中国儿童ALL易感性验证，发现位于ARID5B基因的rs10821936和rs10994982与ALL易感性相关[9-10]。前期本课题组根据上述基于欧美人群的两个GWAS报道的儿童ALL易感性位点，结合NCBI数据库亚洲人群中风险等位基因频率，就其中12个SNP位点在191例ALL患儿与191例健康志愿者进行了验证，发现ARID5B基因的rs10821936和rs10994982、ZNF230基因的rs7554607以及IKZF1基因的rs11978267和rs4132601为ALL潜在易感性位点，暂未发现国外GWAS报道的其他SNP位点与ALL发病的相关性[11]。因此，为了排除抽样误差，本课题组在前期研究的基础上，扩大样本量，增加365例病例对这12个SNP位点进行了基因分型，研究这些SNP位点与中国儿童ALL易感性的关系。

白血病疗效是肿瘤细胞、药物以及机体之间相互作用的结果。基于白血病细胞生物学特征的危险度分层（主要是遗传变异分型）为白血病的精准治疗奠定了基础。近年来生殖系细胞的遗传变异对ALL患儿预后影响越来越受到关注。已经发现抗白血病药物的代谢酶GSTM1[12]、DHFR[13]以及转运蛋白ABCC4[14]、ABCB1[15]和儿童ALL预后有关。此外，已经公认ALL细胞的IKZF1基因突变或缺失和预后相关，IKZF1胚系变异是否和儿童ALL预后有关同样值得研究。

1 资料和方法

1.1 样本量估计 根据前期研究结果，发现ARID5B基因的rs10821936位点CC基因型在病例组和对照组的频率分别为0.237和0.112[11]。在α=0.05，1-β=0.08的水平按照病例对照研究样本量计算最小样本量为144例。

1.2 研究对象 包括2009年5月20日至2014年10月28日在SCMC诊断为ALL并严格按照SCMC-ALL-2005方案治疗的365例患者，以及2008年至2017年在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院收治的191例ALL患儿和191例健康志愿者[11]，191例健康志愿者均为正常体检的志愿者，无肿瘤疾病。病例均经骨髓涂片的形态学评估结合免疫表型分析、核型分析进行诊断。染色体易位，如：t（12；21）（ETV6-RUNX1），t（1；19）（TCF3-PBX1），t（9；22）（q34；q11）（BCR-ABL）和11q23/MLL重排使用反转录-聚合酶链反应或（和）荧光原位杂交确定。依据SCMCALL-2005化疗方案危险度分级标准将患儿划分为：低危（LR）、中危（IR）及高危（HR）。最终危险组是根据治疗反应和微小残留病（miuimell residual disease，MRD）水平确定的。MRD使用流式细胞术确定，灵敏度为0.01%。

1.3 随访 所有SCMC诊断的365例ALL患儿自出院之日起开始随访。OS定义为从确诊至任何原因导致的死亡或末次随访时间。EFS定义为从确诊至首个事件发生或末次随访时间。事件定义为复发、死亡、耐药、放弃治疗及第二肿瘤。复发定义为完全缓解后出现骨髓复发（骨髓原始+幼稚细胞大于25%）和（或）髓外复发包括中枢神经系统复发（出现相应的症状和体征以及脑脊液中白血病细胞≥5×106/L） 和睾丸复发（病理活检证实有白血病细胞浸润）。放弃治疗被定义为未能完成治愈性治疗。失访定义为完成治愈性治疗后失去联系。随访终点为2019年12 月，随访时间为6.8（0.09～10.51）年。

1.4 靶向多重PCR扩增子的文库构建与二代测序

1.4.1 文库构建：365例患儿缓解期骨髓冻存细胞采用德国Qiagen公司的QIAamp®DNA Blood Mini Kit（cat. no.51104）抽提基因组DNA，-20 ℃冰箱保存。取1 μL所提基因组DNA，采用美国Thermo Fisher公司的Qubit®dsDNA HS Assay Kits（cat. no.Q32854）通过Qubit®3.0荧光仪测定基因组DNA浓度。采用iGeneTech®研发的MultipSeq®CustomPanel（IGMU160V1）试剂盒通过两步PCR扩增方法来完成目标区域扩增和建库。

1.4.2 二代测序和生物信息分析：使用上述试剂盒构建出的合格文库，在美国Illumina公司的NextSeq 6000测序仪上进行测序。原始测序数据使用Burrows-Wheeler Aligner软件（BWA v 0.7. 17-r1188）与人类基因组参考序列（hg19）进行比对[16]，然后用samtools软件[17]对比对结果做单核苷酸多态性位点检测分析（筛选条件：比对质量＞20，同时测序深度＞500），用ANNOVAR软件[18]对检测出的多态性位点进行功能注释。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS23.0软件进行分析。计数资料用率及百分比表示，病例组和对照组基因型分布和等位基因频率的差异比较采用χ2检验；Logistic回归分析所选SNP与ALL风险的相关性；OS、EFS及累积复发率采用Kaplan-Meier分析方法进行评估，组间差异用Log-rank检验进行分析；预后因素的影响采用单因素和多因素Cox回归模型分析；所有统计分析均为双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿临床特征 纳入研究的556例患儿的临床特征见表1。

表1 ALL患儿临床特征（n=556）

2.2 随访结果 截至随访终点时间2019年12月，在365例患儿中，中位随访时间为6.8（0.1～10.5）年。其中62例（17.0%）患儿复发，25例（6.8%）患儿死亡，15例（4.1%）患儿放弃治疗，4例（1.1%）患儿失访，3例（0.8%）患儿转院。

2.3 12个SNP位点与儿童ALL易感性的关系 对对照组进行H-W平衡检检，观察到所有基因型都符合H-W平衡[11]。病例组和对照组中SNP的基因型分布和等位基因频率及其与儿童ALL易感性的关系见表2-3。Logistic回归分析显示ARID5B基因的rs10821936位点CC基因型、风险等位基因C与ALL风险增加显著相关（P＜0.05）；rs10994982位点AG基因型、AA基因型、风险等位基因A与ALL风险增加显著相关（P＜0.05）；位于IKZF1基因的rs11978267位点GA基因型、风险等位基因G与ALL风险增加显著相关（P＜0.05）；rs4132601位点GT基因型、风险等位基因G与ALL风险增加显著相关（P＜0.05）；位于ZNF230基因的rs2191566位点CC基因型、风险等位基因C与ALL风险增加显著相关（P＜0.05）。

表2 12个SNP位点与ALL易感性的关系（n=556）

续表2

2.4 12个SNP位点与儿童ALL预后的关系 在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院收治的191例ALL患儿因病例资料收集不完善未纳入该部分分析，所以该部分分析仅包含在SCMC诊断为ALL的365例患儿。通过Kaplan-Meier方法进行生存分析发现，LOC102723724基因的rs11155133位点AA、AG、GG基因型OS、EFS及累积复发率差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；SIAT7C基因的rs10873876位点CC、TC、TT基因型EFS及累积复发率差异有统计学意义（P＜0.05），见图1-2。单因素及多因素Cox回归分析显示，LOC102723724基因的rs11155133位点GG基因型及SIAT7C基因的rs10873876位点TC基因型是EFS的不良预后因素（P＜0.05），同时也是累积复发率的不良预后因素（P＜0.05）。见表4-5。

表4 EFS的单因素和多因素Cox回归分析（n=365）

图1 LOC102723724基因的rs11155133位点AA、AG、GG基因型的生存曲线图（n=365）

图2 SIAT7C基因的rs10873876位点CC、TC、TT基因型的生存曲线图（n=365）

3 讨论

ALL在儿童和青少年中的癌症发病率最高，其病因在很大程度上仍未知[19]。通过对人类基因组的分析，确定了与ALL易感性有关的21个SNP位 点[7-8]。本课题组在前期研究基础上扩大样本量，对欧美人群易感性相关的12个SNPs位点进行验证，发现ARID5B基因的rs10821936和rs10994982以及ZNF230基因的rs7554607多态性位点与我国ALL易感性相关，IKZF1基因的rs11978267和rs4132601多态性位点可能与中国ALL易感性相关，与前期研究结果一致[11]。在单纯扩大病例组后，与前期研究结果比较，我们发现与ALL易感性相关及不相关的位点在中国儿童人群中未发生任何变化，说明SNP位点确实具有人群特异性。

在易感性研究中值得一提的是IKZF1基因。早在2009年PAPAEMMANUIL等[7]及TREVIÑO等[8]分别报道了IKZF1基因的rs11978267和rs4132601位点与ALL易感性相关。WANG等[9]对rs4132601位点在中国儿童ALL与健康人群中进行了验证，未发现与中国人群儿童ALL易感性相关。我们的研究发现IKZF1基因的rs11978267和rs4132601这两个位点的杂合基因型及风险等位基因与ALL风险增加显著相关，但风险等位基因的纯合基因型因病例数少未观察到与ALL风险增加有关[11]。进一步分析rs4132601位点基因型TT、GT、GG及风险等位基因G频率在 PAPAEMMANUIL等[7]、WANG等[9]及我们的病例-对照研究中分布情况，发现与欧美人群相比，中国人群G等位基因携带者（GT、GG）及风险等位基因G频率明显降低，进一步表明SNP位点确实具有人群特异性。随后我们将WANG等[9]的研究数据和我们的合并，发现rs4132601位点GT基因型、GG基因型、风险等位基因G与ALL风险增加显著相关（见表3），表明扩大样本后，证实该位点的确与中国儿童ALL易感性相关。而rs11978267位点由于缺乏在中国儿童ALL的研究数据，不能进一步确定该位点与ALL易感性的关系，后期可扩大样本量进行验证。

表3 rs4132601位点与ALL易感性的关系（n=1 124）

近年来，儿童ALL的疗效有了很大提高，大部分患儿可以用化疗治愈。SCMC-ALL-2005研究是我国最早基于MRD监测进行危险度分层治疗的多中心临床研究队列。该研究历时10年，共入组治疗1 085例初诊ALL病例，获得5年EFS（68.3±1.4）%、OS（80.0±1.2）%的疗效。在这个研究中充分体现了危险度分层治疗的优势，也体现了MRD对与危险度分层的重要性。该研究的单因素分析中35 d MRD对预后的影响非常显著。但是，将危险度分层也作为多变量之一进行多因素分析时，35 d MRD不再是影响预后的独立危险因素。同样年龄大于10岁、诊断时白细胞计数＞50×109/L以及T-ALL也同样不再是影响预后的独立危险因素。这可能是因为危险度分层已经包涵了影响预后的诊断生物学特征以及基于MRD的治疗反应信息，更能体现预后的预测价值。此外，根据危险度分层进行调整的治疗强度也改变了具有包括MRD阳性等危险因素的患者的最终预后[5]。本研究大部分样本来自SCMCALL-2005研究队列后5年的病例，其中这个队列的临床记录完整，所以也只对这些病例进行了预后分析。同样这部分患者的35 d MRD在单因素分析时可见非常显著的预后影响，但在多因素分析中未能显示显著性。本研究对儿童ALL易感性相关的12个SNP位点与疾病预后进行的相关分析发现，无论是单因素分析还是和危险度分层等预后相关因素一起进行多因素分析，SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133多态性位点均与ALL预后显著相关，表明这些遗传因素是独立于现行ALL风险分层模型以外的独立危险因素。这再次证实化疗对肿瘤细胞的杀伤作用，不仅取决于肿瘤细胞自身的遗传特征，还取决于宿主固有的遗传特征[20]。目前，根据分子标志物调整治疗强度是提高ALL治愈率的主要策略之一[4]。但是，由于研究数据相对缺乏，宿主的胚系遗传特征通常不用于ALL患者危险度分层或治疗强度的调整。候选基因研究表明，遗传多态性影响白血病治疗结果[12，14]。 也有研究表明与ALL易感性相关的SNP也与ALL预后相关[21]。如XU等[21]在2012年首次提出与ALL易感性相关的SNP也与ALL预后相关，该研究中发现ARID5B基因的rs10821936和rs10994982位点与ALL易感性相关但与预后无关。MOSAAD等[22]研究发现ARID5Brs10821936和rs10994982基因型之间的OS和DFS没有显著差异。MULLIGHAN等[23]研究表明IKZF1可以作为儿童ALL的肿瘤抑制因子，其丢失与预后不良有关。2017年BIELSKA等[24]报道IKZF1rs4132601基因多态性影响弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的治疗结果。2020年MOSAAD等[19]研究IKZF1rs4132601和rs11978267基因多态性与ALL预后的关系发现rs4132601 GG基因型是成人ALL预后不良的危险因素但与儿童ALL预后无关。本研究提示SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133多态性位点与预后显著相关，可作为指导患儿危险度分层的生物学标志物，选择合适的化疗方案，提高预后。

表5 累积复发率的单因素和多因素Cox回归分析（n=365）

SIAT7C属于唾液酸转移酶家族，越来越多的研究表明，异常唾液酸化与恶性肿瘤的表型密切相关，包括增殖、侵袭、转移和耐药性[25-26]。最近一项研究表明，唾液酸化和唾液酸转移酶可能是急性T淋巴细胞白血病多药耐药的潜在生物标志物[27]。SIAT7Crs10873876多态性位点位于基因的内含子上，内含子可能通过调节转录速率或通过影响转录产物的长度来调节基因表达。因此，我们推测SIAT7Crs10873876 TC基因型影响ALL预后可能与抗白血病药物耐药有关。LOC102723724是一个RNA基因，属于长非编码RNA（lncRNAs），研究表明， lncRNAs转录物作为潜在的诊断和（或）预后生物标志物出现在不同的人类疾病中，包括恶性血液病[28-29]。 有研究提出lncRNAs与ALL生存率差和复发趋势增加有关[30-31]。因此，可能解释LOC102723724rs11155133 GG基因型影响ALL预后的原因。

综上所述，ARID5B基因的rs10821936和rs10994982、ZNF230基因的rs7554607以及IKZF1基因的rs11978267和rs4132601为中国儿童ALL潜在易感性位点。本研究在中国儿童中报道SIAT7C基因的rs10873876以及LOC102723724基因的rs11155133这两个白血病易感性相关位点与儿童ALL预后相关，为白血病的诊断、治疗及预防工作提供了一定的帮助，有必要针对以上SNP位点开展进一步临床试验研究。