超高压辅助脱壳对虾夷扇贝肌原纤维蛋白生化特性及结构的影响

陈启航，文丽华，陈小娥,，方旭波，凌建刚，宣晓婷

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2.宁波市农业科学研究院农产品加工研究所，浙江 宁波 315000）

虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）味道鲜美、营养丰富，其贝肉是食用的主要部位[1-2]。传统的扇贝加工工艺主要采用手工脱壳和加热脱壳，其中手工脱壳存在脱壳效率低、贝肉完整性差的缺点，而加热脱壳易导致蛋白变性[3-4]。超高压技术高效方便、能耗低，不仅脱壳率较高，且不会影响产品的品质，是当前食品加工领域研究的热点[5]。目前国内外学者对超高压技术在扇贝中应用的研究，主要集中在脱壳工艺[6-8]、保鲜包装[9]、质构[10]等方面。巩雪等[8-9]对扇贝的得肉率、持水率、总挥发性盐基氮含量及菌落总数等指标进行研究，发现当压强300 MPa、保压时间180 s时，扇贝的脱壳率和得肉率较高，同时还发现通过超高压处理并存放8 d后，扇贝的保鲜指标与未处理组相比，保鲜效果达到预期。孙少斌[10]通过比较超高压处理与热处理对扇贝的影响，发现扇贝经过超高压处理后口感方面比热处理组鲜嫩。

肌原纤维蛋白属于盐溶性蛋白，是贝肉的重要组成部分，其生化特性和结构的变化会对扇贝的食用品质以及商品价值产生影响[11-13]。超高压在提高脱壳效果的同时也能作用于蛋白等生物大分子，使其肌原纤维蛋白的生化特性发生一定程度变化，导致蛋白变性。叶韬等[14]利用超高压技术处理小龙虾虾仁，结果发现超高压处理后其肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性下降，表面疏水性上升。周果等[15]采用超高压技术处理梭子蟹蟹肉，结果发现经过超高压处理，蟹肉的肌原纤维蛋白总巯基含量呈现下降趋势。因此，采用超高压技术处理虾夷扇贝贝肉的同时，除了研究超高压工艺对扇贝脱壳效果的影响外，关注超高压对其肌原纤维蛋白生化特性和结构的影响也十分重要。

本实验以虾夷扇贝为研究对象，通过超高压处理，研究不同压力对扇贝脱壳效果的影响，依据肌原纤维蛋白的含量、总巯基含量、羰基含量、表面疏水性、Ca2+-ATPase活力等指标，分析超高压对贝肉肌原纤维蛋白生化特性产生的影响，并利用圆二色光谱探讨肌原纤维蛋白二级结构的变化，完善超高压技术在贝类脱壳中的应用研究，为扇贝加工和相关产品的进一步开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活虾夷扇贝购于宁波路林水产品交易市场；牛血清白蛋白 北京Solarbio公司；Ca2+-ATPase活力测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；Tris-马来酸、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、2,4-二硝基苯肼 上海Aladdin公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

CQC2L-600型全液相超高压设备 北京速原中天股份有限公司；MS105DU电子分析天平、Delta320 pH计瑞士Mettler Toledo仪器有限公司；H1850R型台式高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；ST-752s紫外-可见光分光光度仪 上海光谱仪器有限公司；MOS-450圆二色光谱仪 法国Biologic公司。

1.3 方法

1.3.1 超高压处理样品

将清洗干净的虾夷扇贝分装在聚乙烯袋中，分别在150、200、250、300、350 MPa下处理3 min，温度为20～25 ℃。另以手工脱壳（直接用手术刀手工脱壳）和蒸煮脱壳（鲜活扇贝100 ℃水蒸煮3～5 min）为对照组。将样品标记后，置于4 ℃下用于后续各项指标的测定。

1.3.2 脱壳效果指标测定

1.3.2 .1 脱壳时间的测定

参考汪兰等[16]的研究方法，对扇贝分别进行手工脱壳、蒸煮脱壳和超高压脱壳，记录扇贝脱壳所用的时间，并计算出平均每只扇贝的脱壳时间。

1.3.2 .2 得肉率的测定

参考王敏[17]的研究方法，在超高压处理后，贝肉用滤纸吸干并称质量，按式（1）和式（2）分别计算脱壳后贝肉与贝壳的质量比（Rm-s）和脱壳后贝肉与整个扇贝的质量比（Rm-t），通过Rm-s和Rm-t反映贝肉产出率。

式中：mm为脱壳后贝肉质量/g；ms为脱壳后贝壳质量/g；mt为脱壳前整个扇贝质量/g。

1.3.3 肌原纤维蛋白特性及结构的测定

1.3.3 .1 肌原纤维蛋白的提取与质量浓度的测定

参照崔燕等[18]的方法对贝肉肌原纤维蛋白进行提取与质量浓度的测定。

1.3.3 .2 肌原纤维蛋白总巯基含量的测定

参考Benjakul等[19]的方法测定总巯基含量，并略作修改。取0.25 mL肌原纤维蛋白溶液，加入2.5 mL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（含8 mol/L尿素，pH 8.0），充分混匀后，分别加入50 µL 0.01 mol/L的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，在40 ℃条件下水浴15 min，测412 nm波长处吸光度。使用摩尔消光系数13 600 L/（mol·cm）计算总巯基含量。

1.3.3 .3 肌原纤维蛋白羰基含量的测定

参考Jia Guoliang等[20]的方法，对贝肉肌原纤维蛋白的羰基含量进行测定。

1.3.3 .4 肌原纤维蛋白表面疏水性的测定

参考崔燕等[18]的方法，对贝肉肌原纤维蛋白的表面疏水性进行测定。

1.3.3 .5 Ca2+-ATPase活力的测定

参考闫春子等[21]的方法，对贝肉肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活力进行测定。

1.3.3 .6 圆二色光谱分析

取0.1 mg/mL提取的肌原纤维蛋白样品，经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行圆二色光谱扫描，以超纯水作为空白。测定条件：0.1 cm石英样品池，光径0.1 cm、带宽1 nm、测定温度25 ℃、波长范围190～250 nm、扫描速率0.5 nm/s，用平均残基椭圆值[θ]表示圆二色光谱数据，单位为deg·cm2/dmol。通过仪器自带的软件计算出各条件下肌原纤维蛋白的二级结构单元的相对含量。

1.4 数据处理与分析

每组实验平行3 次，结果以平均值±标准偏差来表示。应用Origin Pro 8.5软件绘图，通过SPSS 17.0进行单因素方差分析，以P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 超高压对虾夷扇贝脱壳效果的影响

经过超高压脱壳后得到的贝肉产出率可通过得肉率Rm-s和Rm-t反映,其中Rm-s表示脱壳后贝肉与贝壳的质量比，反映贝肉的完整性，而Rm-t则表示脱壳后贝肉与整个扇贝的质量比，反映贝肉的占比[17]。扇贝脱壳效率由脱壳时间反映，脱壳时间直接对扇贝的脱壳成本和生产效率产生影响[16]。表1展示了不同压力条件下超高压对扇贝脱壳效果的影响，可以看出，与蒸煮脱壳和手工脱壳相比，超高压处理组脱壳时间显著缩短（P＜0.05），并且得肉率相对较高。在实验条件范围内，随着超高压压力的增加，脱壳时间先缩短后延长，而扇贝的得肉率则先提高后下降。当压力增加至250 MPa时，扇贝的脱壳时间最短，仅为7.25 s，而得肉率Rm-s和Rm-t最高，分别达88.55%和65.86%。分析原因可能是壳肉之间的组织蛋白因超高压作用产生变性，在一定范围内，随着压力的不断增大，蛋白变性程度越大，壳肉分离更容易，得肉率也随之提升。超过250 MPa，扇贝得肉率呈下降趋势，脱壳时间延长。原因可能是过高的压力造成贝肉肌纤维蛋白结构被破坏，肌肉出现破裂损失，从而导致扇贝得肉率下降[8]。综上所述，适当的压力条件能够提高扇贝的得肉率和缩短脱壳时间。

2.2 超高压对虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白氧化的影响

2.2.1 超高压对肌原纤维蛋白质量浓度的影响

如图1所示，与手工脱壳相比，超高压和蒸煮处理均使贝肉肌原纤维蛋白质量浓度显著下降，其中蒸煮脱壳组贝肉肌原纤维蛋白质量浓度下降最为显著（P＜0.05），仅为手工脱壳组的49.73%。说明蒸煮处理严重破坏了蛋白空间构象，使蛋白变性。与蒸煮处理相比，超高压处理相对温和，能够降低贝肉肌原纤维蛋白的损失。且随着压力的增加，贝肉肌原纤维蛋白质量浓度逐渐降低，超过250 MPa时，肌原纤维蛋白质量浓度下降趋势加快。王芝妍等[7]研究了超高压对中华管鞭虾虾仁肌原纤维蛋白质量浓度的影响，结果表明当超高压压力大于200 MPa时，肌原纤维蛋白质量浓度逐渐下降，这与本实验结果类似。叶韬等[14]在研究超高压对小龙虾虾仁肌原纤维蛋白质量浓度影响时亦得到类似结果，认为超高压会引起蛋白质变性和聚集，使肌原纤维蛋白的盐溶性降低，导致肌原纤维蛋白质量浓度下降。

图1 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白质量浓度的变化Fig.1 Changes in myofibrillar protein content in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.2 超高压对肌原纤维蛋白总巯基含量的影响

由图2可知，与手工脱壳组相比，蒸煮脱壳组的总巯基含量急剧下降，为35.3 nmol/mg，降低了29.54%，可能是加热破坏蛋白分子之间的作用力，巯基暴露后易被氧化为二硫键，使蛋白发生聚集和变性，引起巯基含量下降[22]。当压力为150 MPa时，总巯基含量与手工脱壳组差异不显著（P＞0.05）。压力超过250 MPa时，其总巯基含量发生显著变化（P＜0.05）。说明随着压力的增大，原本位于分子内部的巯基在压力的作用下暴露出来，从而导致氧化，因此总巯基含量减少。随着压力的增大，扇贝贝肉肌原纤维蛋白总巯基含量总体呈下降趋势。这与周果等[15]的研究结果相似。

图2 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白总巯基含量的变化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.3 超高压对肌原纤维蛋白羰基含量的影响

羰基的形成由自由基氧化修饰蛋白质所引起，其含量变化可表征蛋白质的氧化变性程度，含量越高表示蛋白氧化程度越高[23]。由图3可知，超高压和蒸煮脱壳处理后肌原纤维蛋白的羰基含量均显著高于手工脱壳组（P＜0.05），蒸煮脱壳组羰基含量最高，比手工脱壳组升高了2.67 倍。羰基含量随着压力的增大逐渐上升，说明贝肉肌原纤维蛋白氧化变性程度也随之更高。这与郭丽萍[24]的研究结果相似。

图3 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白羰基含量的变化Fig.3 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.4 超高压对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

蛋白质分子内部的疏水基团暴露情况可由表面疏水性反映，表面疏水性越大说明基团暴露越多[25]。由图4可知，与手工脱壳组相比，150、200、250、300、350 MPa处理后扇贝贝肉肌原纤维溴酚蓝结合量分别增加了0.30、0.34、0.39、0.51、0.70 倍（P＜0.05），说明扇贝的疏水基团多数位于蛋白质分子内部，表面疏水性低，在超高压作用下，蛋白质分子伸展，基团逐渐外露，从而使表面疏水性上升。蒸煮脱壳组相较手工脱壳组，其表面疏水性增加了0.91 倍。这与李长乐[26]的研究结果相似。

图4 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白表面疏水性的变化Fig.4 Changes in surface hydrophobicity of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.2.5 超高压对肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的影响

肌球蛋白结构的完整性可由Ca2+-ATPase活性体现，肌球蛋白的稳定程度会对肌原纤维蛋白的稳定性产生一定影响[15]。由图5可知，超高压处理组随着压力的升高，其肌原纤维蛋白的Ca2+-ATPase活力呈下降趋势。可能原因是超高压处理使贝肉肌球蛋白头部空间构象发生变化，造成Ca2+-ATPase活力降低。超高压处理组在150 MPa时Ca2+-ATPase活力与手工脱壳组无显著差异（P＞0.05），但超过250 MPa时Ca2+-ATPase活力与手工处脱壳相比显著降低（P＜0.05），其中350 MPa时Ca2+-ATPase活力比手工脱壳组降低了37.35%，说明压力过高的情况下Ca2+-ATPase易失活。蒸煮脱壳组的Ca2+-ATPase活力急剧下降，比手工脱壳组降低了45.78%。这与闫春子等[21]的研究结果相似。

图5 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活力的变化Fig.5 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

2.3 超高压对虾类扇贝贝肉肌原纤维蛋白二级结构的影响

圆二色光谱作为一种研究蛋白质二级结构的方法，不仅快捷有效，而且能够显示生物大分子主链构象信息[27-28]。由图6可知，手工脱壳组扇贝贝肉肌原纤维蛋白在209 nm、221 nm波长附近出现两个明显的负峰，其主要由α-螺旋结构引起，是α-螺旋结构的特征吸收峰[29-30]，说明α-螺旋结构丰富。蒸煮脱壳组在209、221 nm波长附近出现的两个负峰强度较弱，说明α-螺旋含量较低，蒸煮处理对肌原纤维蛋白二级结构产生影响较大。超高压组在192 nm波长附近出现正峰，在209 nm、221 nm波长附近出现两个负峰。在150～350 MPa处理3 min条件下，蛋白圆二色光谱中α-螺旋对应的负峰强度降低，说明超高压破坏了蛋白的有序结构，α-螺旋结构部分丧失。

图6 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白圆二色光谱Fig.6 Circular dichroism spectra of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

蛋白质二级结构是多肽链利用氢键进行折叠或盘旋，形成规则性和周期性的结构，包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲结构这几种[31-32]。由图7可知，与手工脱壳组相比，超高压脱壳和蒸煮脱壳处理均对扇贝贝肉肌原纤维蛋白的构象单元组成产生一定程度的影响。在超高压处理组中，150 MPa处理组肌原纤维蛋白中β-转角、β-折叠与手工脱壳组相对含量基本接近。随着施加压力由150 MPa增至350 MPa，肌原纤维蛋白中α-螺旋和β-转角相对含量逐渐降低、无规卷曲和β-折叠相对含量逐渐增加，说明压力的增加使其结构紧密程度下降，增加了其柔性，同时维持蛋白质分子内氢键结合作用减弱，其蛋白质分子展开程度增加，从而对肌原纤维蛋白的二级结构产生一定影响[33-34]。无规卷曲相对含量的增加可能与蛋白分子中α-螺旋的展开有关[35]。当压力达到250 MPa后，随着压力继续加大，α-螺旋相对含量下降，β-转角相对含量降低的幅度较小，基本无明显变化。相比而言，蒸煮脱壳组肌原纤维蛋白中的α-螺旋相对含量最低，无规卷曲相对含量高于手工脱壳组，表明蛋白紧密的螺旋结构向无规则状态变化，引起蛋白质的变性，蒸煮处理增强了扇贝贝肉肌原纤维蛋白的无序程度，对贝肉肌原纤维蛋白二级结构产生较大的破坏，超高压状态下其二级结构相对更为有序。综上所述，超高压处理会对蛋白构象产生一定影响。

图7 不同处理条件下虾夷扇贝贝肉肌原纤维蛋白二级结构含量的变化Fig.7 Changes in secondary structure contents of myofibrillar protein in the muscle of Patinopecten yessoensis subjected to different treatments

3 结 论

超高压处理对虾夷扇贝闭壳肌肌原纤维蛋白的生化特性和二级结构造成了一定影响。综合分析超高压处理后扇贝的脱壳效率以及贝肉肌原纤维蛋白的质量浓度、总巯基含量、羰基含量、表面疏水性、Ca2+-ATPase活力等指标，可以看出，当压力处于150 MPa和200 MPa时，超高压处理对贝肉肌原纤维蛋白的影响相对较低，在一定程度上维持了蛋白的功能特性。随着压力的升高，圆二色光谱图中的两个负峰逐渐消失，α-螺旋相对含量逐渐降低，当压力超过250 MPa时，α-螺旋相对含量呈下降趋势。压力增大时蛋白从紧密的螺旋结构向无规则状态变化，蛋白分子内疏水基团暴露，导致蛋白质发生一定程度的氧化、变性及降解，影响了蛋白构象。综上所述，适宜的超高压条件为250 MPa保压处理3 min。本实验为研究扇贝贝肉肌原纤维蛋白的生化特性及结构提供了一定的参考，进一步拓宽了虾夷扇贝及相关产品研发思路。