含酪氨酸二肽在脂质体体系中的抗氧化活性与供电子能力

陈 冲，赵谋明，孙为正

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641）

活性氧是诱导细胞损伤并最终导致衰老和一系列人类疾病（如炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病和癌症等）的关键因素[1-3]。多肽作为一种新型来源的天然抗氧化剂已受到广泛关注，它们在各种基于单电子转移反应或氢原子转移反应的抗氧化活性检测方法中显示出优异的功能活性，如自由基清除能力、过渡金属离子螯合能力、还原能力以及脂质氧化抑制能力等。研究表明，分子质量低于3 kDa的小肽通常具有更高的抗氧化活性[4]，包括一些天然生物活性肽，如谷胱甘肽[5]、肌肽[6]、高肌肽和鹅肌肽等。氧化应激诱导的氧化或硝化反应通常以酪氨酸残基作为主要攻击目标，它在自由基清除、脂质过氧化抑制以及细胞保护等方面也发挥着重要作用[7]。自由基介导的酪氨酸残基硝化反应与蛋白质结构、硝化机理以及酪氨酸残基周围的环境密切相关，靠近酪氨酸残基的氨基酸类型（是否产生氢键及携带电荷等）会显著影响其硝化作用[8]。一些来源于动物或植物蛋白质的含酪氨酸二肽（如酪氨酸-酪氨酸、酪氨酸-亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸和酪氨酸-赖氨酸等），因其具有显著的抗氧化活性而备受关注[9-11]。

多肽抗氧化活性与结构的关系一直是该领域的研究热点[12]，目前已知多肽肽链的长短[13]、空间构象[14]以及特定的氨基酸（如疏水性氨基酸、带电荷氨基酸和芳香族氨基酸等）组成[15]、特定氨基酸残基的位置[16]等都能影响多肽的抗氧化活性。多种化学或生物学相关的体外实验被用于评估多肽的抗氧化活性，涉及到包括均相溶液、双层磷脂、脂质体、水胶束分散体等体系，所测得的抗氧化活性会随所用体系不同而发生变化[16-18]。多肽在非均相体系中的抗氧化作用机制可能涉及到与均相体系不同的化学和/或物理途径，还会受到其他因素（如多肽在体系中的分布、定位、取向和迁移）和体系自身稳定性的影响[17,19]。综上所述，为了能更好地运用抗氧化肽这一潜在抗氧化剂资源，对于其在复杂体系中的抗氧化活性与结构的关系及其在均相与非均相体系中的活性差异研究显得十分重要。

本研究选择了5 种结构相似的含酪氨酸二肽（酪氨酸-酪氨酸（Tyr-Tyr）、酪氨酸-苯丙氨酸（Tyr-Phe）、苯丙氨酸-酪氨酸（Phe-Tyr）、酪氨酸-丙氨酸（Tyr-Ala）和酪氨酸-丝氨酸（Tyr-Ser）），探究其在脂质体体系中的抗氧化活性与其自身结构特性的联系，及其在脂质体中的抗氧化活性与在水溶液中的还原能力的差异与联系，以加深对小肽在非均相体系中抗氧化活性与其结构相关性的理解，为其在食品工业中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

合成二肽Tyr-Tyr、Tyr-Phe、Phe-Tyr、Tyr-Ala和Tyr-Ser（纯度均高于95%） 南京杰肽生物科技有限公司；L-α-磷脂酰胆碱（L-α-phosphatidylcholine，PC）、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐（2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）、L-酪氨酸、L-抗坏血酸（VC）、(+)-α-生育酚（VE）、L-还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和L-肌肽美国Sigma-Aldrich公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TLE204电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司；CHI 660E电化学工作站 中国上海辰华仪器有限公司；Varioskan多功能酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外吸收光谱的测定

用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）分别将含酪氨酸二肽配制为一系列浓度标准溶液，在200～340 nm波段范围内以1 nm采样间距进行紫外吸收光谱扫描并记录其吸收光谱。

1.3.2 还原力的测定

还原力测定参考Oyaizu[20]的方法并作适当修改。取2 mL各样品（酪氨酸、含酪氨酸二肽和阳性对照（GSH和L-肌肽））的溶液（2 mmol/L）分别加入PBS（0.2 mol/L、pH 6.6）2 mL混匀，再加入2 mL铁氰化钾溶液（2 g/100 mL），混匀后50 ℃保温20 min。然后快速冷却，加入2 mL三氯乙酸溶液（10 g/100 mL），混匀后4 ℃下以3 000 r/min离心10 min。取离心后上清液2 mL加入2 mL超纯水和0.4 mL三氯化铁溶液（0.1 g/100 mL），混匀后室温静置10 min，于700 nm波长处测定吸光度（A700nm）。相同条件下以PBS代替样品进行反应作为空白组，并将其结果作为背景扣除。

1.3.3 循环伏安特性的测定

采用循环伏安特性表征酪氨酸和含酪氨酸二肽的电化学行为，具体操作参考Yang Gang等[21]的方法。使用CHI 660E电化学工作站的三电极体系，以铂电极和饱和甘汞电极（saturated calomel electrode，SCE）为参比电极，以玻碳电极（直径3.0 mm）为工作电极。所有被测样品（1 mmol/L）用PBS（0.1 mol/L、pH 7.0）现用现配，并在进行循环伏安法分析之前用高纯度氮气处理15 min以除去溶解在这些样品中的氧气。分别用新抛光的玻碳电极以10 mV/s的速率扫描，收集样品在0.25～0.85 V vs.SCE（相对于SCE的电极电位）之间的循环伏安图。

1.3.4 脂质体模型体系中抗氧化活性的测定

根据Roberts等[22]的方法制备脂质体模型。将10 mL含有3 μmol PC的氯仿溶液与5 mL无水乙醇加入50 mL圆底烧瓶中，然后用旋转蒸发仪在30 ℃下减压除去溶剂。用氮气除去残留在烧瓶壁磷脂薄膜上的溶剂后，加入20 mL PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）进行超声水合，然后将所得混合物过聚醚砜滤膜（孔径0.22 μm）3 次，得到单层脂质体悬浮液。含有受试物的脂质体通过将水合所用PBS替换成一定浓度的（水溶性）样品（包括含酪氨酸二肽、VC和GSH）溶液或在水合前将（脂溶性）样品（即VE）溶于无水乙醇而制得。以含有一系列浓度的VC、VE和GSH溶液的脂质体作为阳性对照组，不含任何抗氧化剂的单层脂质体悬浮液作为空白组。

脂质氧化通过水溶性自由基引发剂AAPH热解产生的自由基进行诱导[19]。分别取2.5 mL脂质体悬浮液加入AAPH溶液（20 μL、终浓度750 μmol/L）后混匀，在37 ℃下孵育200 min，用酶标仪每5 min监测234 nm波长处的吸光度（A234nm）变化。脂质氧化抑制率按下式计算。

式中：AUC为含受试物脂质体的吸光度-时间曲线下面积；AUC0为空白脂质体的吸光度-时间曲线下面积。

1.4 数据处理与分析

所有实验重复3 次，数据以平均值或平均值±标准差的形式表示。采用SPSS 24.0软件中的方差分析法对数据进行差异显著性分析，以P＜0.05表示差异显著；并采用Pearson相关系数法对含酪氨酸二肽抗氧化结果进行相关性分析，以P＜0.05为显著相关。

2 结果与分析

2.1 含酪氨酸二肽的紫外吸收特征分析结果

采用紫外分光光度计对含酪氨酸二肽进行了紫外吸收波段扫描，并以酪氨酸作为对照，结果如图1所示。以0.01 mol/L、pH 7.4 PBS作为溶剂的Tyr-Tyr在约224 nm波长处有较强吸收峰，在约275 nm波长处有较弱吸收峰（在约281 nm波长处有一个肩峰），其特征吸收曲线分别为y＝0.010 1x+0.018 4（λmax＝224 nm，R2＝0.999）和y＝0.001 7x+0.001 1（λmax＝275 nm，R2＝0.999）。酪氨酸中酚羟基的存在可产生n→σ*跃迁，从而表现为在224 nm波长处出现强吸收；275 nm波长处的吸收则主要归因于其苯酚取代基及羰基所产生的π→π*跃迁及n→π*跃迁。除Tyr-Phe与Phe-Tyr（图1B、C）两者形状特征相似以外，酪氨酸及其余二肽的紫外吸收曲线与Tyr-Tyr相比形状特征相似，而在吸收峰的强度上有些许不同（图1F）：Tyr-Tyr在约224 nm波长处的吸收峰强度明显高于酪氨酸，而Tyr-Ala、Tyr-Ser中丙氨酸及丝氨酸的存在对于其分子内酚羟基在此处的吸收强度有明显的降低作用。Tyr-Phe在220 nm波长处附近不再出现明显吸收峰，且在270 nm波长处附近的吸收峰曲线出现轻微波动（图1B）。主要是由于苯丙氨酸中苯环取代基的存在，其产生的π→π*跃迁在200 nm波长处附近出现较强吸收从而使得224 nm波长处附近的吸收峰不再明显，270 nm波长处附近也倾向于出现苯环的精细结构；且苯丙氨酸在酪氨酸的C端或N端连接对其吸收强度有显著影响。由此可见，构成5 种含酪氨酸二肽的氨基酸组成、排列顺序的差异导致其紫外吸收特征差异明显。

图1 酪氨酸和含酪氨酸二肽的紫外吸收光谱Fig.1 UV absorption spectra of Tyr and Tyr-containing dipeptides

2.2 含酪氨酸二肽的抗氧化活性分析结果

2.2.1 还原力法分析结果

还原力是基于单电子转移反应测定的抗氧化活性[23]，能够反映受试物的供电子能力。以两种常见抗氧化肽GSH和L-肌肽作为阳性对照，对比分析酪氨酸及含酪氨酸二肽的还原力，结果如图2所示。除GSH外，二肽中Tyr-Tyr表现出最高的还原力（A700nm＝0.149 0），其次是Phe-Tyr（A700nm＝0.104 9），而酪氨酸和其余二肽以及L-肌肽还原力较低。有研究也发现含半胱氨酸残基的二肽能够表现出高还原力，而不含半胱氨酸残基的二肽还原力极低[16]。GSH中的半胱氨酸残基所含巯基具有独特的氧化还原及亲核特性，L-肌肽的抗氧化活性主要源于其所含咪唑环[6]，而酪氨酸中酚羟基则是其活性的主要来源。由于还原力反映了抗氧化剂提供电子的能力，因此Tyr-Tyr（含有两个酚羟基）表现出比其他含酪氨酸二肽更高的活性。肽键和C/N端带电荷基团（氨基/羧基）可能参与氧化还原途径[23]，因此，其余二肽显示出不同的还原力，特别是Tyr-Phe和Phe-Tyr，两者虽组成相同，但还原力差异显著（P＜0.05）。而结构更相似的Tyr-Phe、Tyr-Ala和Tyr-Ser三者之间还原力没有显著性差异。

图2 酪氨酸和含酪氨酸二肽（2 mmol/L）的还原力Fig.2 Reducing power of Tyr and Tyr-containing dipeptides at a concentration of 2 mmol/L

2.2.2 循环伏安法分析结果

电化学法可用于测定总还原力，特别是针对低分子质量的抗氧化剂，该方法已广泛运用于食品及饮料的抗氧化能力检测[24]。某些氨基酸或其衍生物（如酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等）的抗氧化性可以通过电化学法测定。它们都是电化学活性化合物，电化学活性肽或蛋白质的伏安特性即来源于氨基酸序列中的这些活性残基[25]。本研究以0.1 mol/L、pH 7.0的PBS作为溶剂，测得受试样品的循环伏安图如图3所示。样品均显示出不可逆氧化的单个阳极峰，而没有阴极峰，表明所有的氧化产物都没有在玻碳电极表面还原，因此，定量分析数据仅由阳极峰确定。

图3 酪氨酸和含酪氨酸二肽（1 mmol/L）的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of Tyr and Tyr-containing dipeptides at a concentration of 1 mmol/L

表1列出了从循环伏安图（图3）中提取出的关键电化学参数，其中氧化电位可用于识别抗氧化剂的类型，而氧化电流则与抗氧化剂的浓度成正比[21]。通常，更低的氧化电位表明化合物具有更高的供电子能力，即更高的抗氧化能力[26]。半波电位通常用于估算物质的标准电化学电位，比氧化电位更准确。本研究中的电化学参数描述了氧化过程，并将样品表征为还原剂。酪氨酸的氧化电流（10.937 μA）最高，表明酪氨酸与玻碳电极表面之间具有最大的电子转移速率，可能与其分子大小及空间位阻有关[27]。受试样品的半波电位分布在相对较窄的范围内（0.510～0.576 V vs.SCE）。其中，Tyr-Tyr的半波电位（0.510 V vs.SCE）最低，即抗氧化性最强，其他样品的半波电位则按Phe-Tyr＜Tyr＜Tyr-X（Tyr-Ser、Tyr-Phe和Tyr-Ala）的升序（P＜0.05）排列。如表2所示，该结果与还原力法的结果具有显著相关性（P＜0.05），可以认为含酪氨酸二肽的氨基酸骨架和静电性质可能影响酪氨酸残基酚羟基的氧化还原特性[28]，从而导致二肽显示出不同的还原能力。

表1 循环伏安图（图3）中提取出的电化学参数Table 1 Electrochemical parameters extracted from cyclic voltammograms shown in Fig.3

表2 含酪氨酸二肽在脂质体与均相体系中的抗氧化活性相关性Table 2 Correlation between antioxidant activity of Tyr-containing dipeptides determined in liposomal system and that in aqueous system

2.2.3 脂质体体系中的抗氧化活性分析结果

由于脂-水界面的存在，使得脂质体体系中的脂质氧化较均相体系更为复杂，脂质体的特性、脂质氧化的起始位置、自由基和抗氧化剂的分布及其与脂质体的相互作用均会对脂质氧化过程产生不同程度的影响[19]。本实验首先研究了不同浓度的VC、VE和GSH在AAPH诱导氧化脂质体体系中对脂质氧化的影响。脂质体样品在234 nm波长处的吸光度能够反映脂质氧化初级产物共轭二烯[19]的含量，脂质氧化抑制率经计算后在表3中列出。从空白组的脂质氧化曲线来看（图4），AAPH诱导脂质氧化能在约75～175 min内迅速生成共轭二烯，随后其生成速率变缓并在200 min左右达到最大值；1.5 μmol/L的抗氧化剂已能显著抑制脂质氧化（抑制率以VC＜GSH＜VE的升序显著递增（P＜0.05））。此外，在本实验浓度范围内，3 种抗氧化剂对于脂质氧化的抑制率与其浓度之间呈现出不同规律的剂量依赖关系：VC对于脂质氧化的抑制率随浓度增加呈线性增长趋势（y＝0.020 4x+0.165 8，R2＝0.975）；GSH的抑制率随浓度增加呈对数型增长趋势（y＝0.227lnx+0.231 3，R2＝0.937），其浓度达到15 μmol/L之后抑制率增加不再显著；VE的抑制率随浓度增加也呈对数型增长趋势（y＝0.104 2lnx+0.595 5，R2＝0.845），但其浓度在达到7.5 μmol/L之后抑制率增加不再显著。总地来说，相同浓度下VC的抑制率始终显著低于VE和GSH（P＜0.05）；在低浓度（＜15 μmol/L）下VE的抑制率显著高于GSH（P＜0.05），而随着浓度进一步增加，两者之间无显著性差异。

图4 含酪氨酸二肽对AAPH诱导脂质体氧化体系中脂质氧化的影响Fig.4 Effect of Tyr-containing dipeptides on AAPH-induced lipid oxidation in liposomal system

AAPH热解所产生的自由基极性较低，能够在磷脂双层膜内自由分配和扩散，因此AAPH自由基在双层膜内大量集中并在此诱导脂质氧化链式反应，从而能在短时间内即导致脂质体体系的剧烈氧化[19]。由于VE具有亲脂性，在双层膜内部疏水区域分布更为广泛，因此对于脂质氧化的抑制效果最为明显。而GSH具有两亲性，倾向于从水相扩散并吸附至脂-水界面，一方面可以直接清除脂质氧化自由基，阻断链式反应，从而对磷脂起到良好的保护作用；另一方面，由于GSH含有带电基团，能与磷脂头部的PO2－及N+(CH3)3发生静电相互作用[29]，从而改变磷脂膜的结构，进一步影响其自身的脂质氧化抑制效果。

在AAPH诱导氧化脂质体体系中，对7.5 μmol/L含酪氨酸二肽的脂质氧化抑制率进行了检测。结果如图4A及表3所示，二肽的抗氧化活性按Tyr-Tyr＞Phe-Tyr＞Tyr-Phe＞Tyr-Ala＞Tyr-Ser的降序排列，但在此浓度下其抑制率均明显低于VC、VE和GSH。对一系列浓度Tyr-Tyr的检测结果进行分析发现，Tyr-Tyr对于脂质氧化的抑制率随浓度增加也呈现出线性增长趋势（y＝0.012 9x+0.020 3，R2＝0.975），但与VC相比抑制率随浓度增加的速率更低。如表2所示，含酪氨酸二肽在脂质体体系中的抗氧化活性结果与还原力法及循环伏安法所得结果均具有显著相关性（P＜0.05），说明在这几种抗氧化活性测定方法中，酚羟基作为电子供体参与了体系中的氧化还原反应，二肽在脂质体中的抗氧化活性与其供电子能力显著相关。有研究指出，在脂质体体系中抗氧化剂的活性不仅受其自身特性（如氧化还原能力、亲脂/水性）的影响，还与脂-水界面的性质（如电荷分布、脂质膜刚度）及其在脂-水界面上的分布和相互作用有关[17]。由VC、VE和GSH的抗氧化分析结果可知，抗氧化剂的亲脂/水性确实会对其在脂质体体系中的抗氧化活性产生影响。作为两亲性化合物，二肽的脂水分配系数可通过计算得出介于－3.25～－0.81之间，亲脂性按照Tyr-Phe＝Phe-Tyr＞Tyr-Tyr＞Tyr-Ala＞Tyr-Ser的降序排列[30]。综合以上结果分析，Tyr-Tyr的脂质氧化抑制率最高，可能是由于其分子内所含酚羟基数量占优势。Tyr-Phe与Phe-Tyr的氨基酸组成及亲脂性一致，然而抑制率及其在还原力法、循环伏安法中所得结果都有明显差异，说明苯丙氨酸连接在酪氨酸的C端或N端可能对于酪氨酸中酚羟基的供电子能力具有明显影响。Tyr-Ala及Tyr-Ser的亲脂性更低，可能是造成其在脂质体体系中抑制率降低的主要原因。此外，5 种二肽与磷脂膜的相互作用对于膜结构的影响及其与抑制率的关系已在前期研究[30]中探讨。

表3 样品在AAPH诱导脂质体氧化体系中的脂质氧化抑制率Table 3 Percentage inhibition of lipid oxidation by dipeptides and other antioxidants in AAPH-induced liposomal system

3 结 论

利用紫外分光光度计对5 种含酪氨酸二肽的紫外吸收特征光谱进行了检测，发现构成含酪氨酸二肽的氨基酸组成及排列顺序会导致其吸收特征的显著差异。利用还原力法及循环伏安法检测了含酪氨酸二肽的供电子能力，发现酚羟基的数量起决定性作用，其余氨基酸的种类以及在C/N端的分布对于酚羟基的供电子能力影响显著。在AAPH诱导氧化脂质体体系中，以VC、VE及GSH为对照对比分析了含酪氨酸二肽的脂质氧化抑制率，结果表明含酪氨酸二肽的抗氧化活性除了与其供电子能力显著相关外，还与其自身的亲脂/水性具有一定的相关性。本研究揭示了含酪氨酸二肽在脂质体体系中的活性与其自身特性的关系，可为其在复杂食品体系实际生产中的进一步应用提供指导。