血清TBULC水平对肺腺癌的诊断价值

车开丽，姜 坤

南京医科大学附属淮安第一医院检验科，江苏淮安 223001

肺腺癌(LUAD)是肺癌最常见的亚型之一[1]。目前，LUAD血清学肿瘤标志物主要包括癌胚抗原(CEA)、糖类抗原-125和胃泌素释放前体等，这些指标的灵敏度和特异度均较低，诊断价值有限，可能造成漏诊[2]。由于缺乏LUAD早期诊断的标志物，无法对患者进行个体化的治疗方案制订、治疗效果评估及复发预测，因此，为了提高LUAD患者的总体生存率，需要寻找具有高特异度和灵敏度的早期诊断标志物。长链非编码RNA(LncRNA)是长度>200个核苷酸的非编码RNA[3]，许多研究报道LncRNA在LUAD的发生、发展过程中起到了重要的作用[4-6]。ZHENG等[7]研究发现，转化生长因子β诱导的长链非编码RNA(TBULC)在LUAD组织中的表达较癌旁组织明显上调，并且与患者肿瘤大小相关，参与肿瘤的浸润、转移。目前尚未见血清TBULC的表达与LUAD关系的相关报道，因此本研究采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血清TBULC在LUAD患者、肺良性结节患者及健康体检者血清中的表达情况，并探讨血清TBULC对LUAD的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年9月至2020年4月于本院就诊的116例LUAD患者作为LUAD组，其中男59例，女57例；年龄23～80岁，平均(59.53±9.92)岁。纳入标准：(1)病理组织标本经本院病理科确诊为LUAD；(2)术前未进行放疗、化疗、靶向治疗或中药治疗等。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并严重心、肝、肺、肾等脏器功能障碍；(3)存在其他慢性疾病；(4)临床病理资料不完整。另外选取肺良性结节患者110例作为肺良性结节组，其中男56例，女54例；年龄25～78岁，平均(58.25±10.02)岁。选取同期110例健康体检者作为对照组，其中男57例，女53例；年龄26～79岁，平均(59.36±10.26)岁。3组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集与处理 采集各组研究对象空腹静脉血3 mL于含有促凝剂的真空采血管中，5 000×g离心5 min，分离血清，4 ℃ 15 000×g离心5 min去除细胞碎片，置于-80 ℃冰箱冻存。

1.2.2RNA提取及反转录 采用RNA提取试剂盒(日本Takara公司)提取血清总RNA，经核酸检测仪(美国赛默飞世尔公司)检测RNA浓度与纯度，选择吸光度(A)260 nm/A280 nm为1.8～2.0的RNA标本，经过反转录试剂盒(日本Takara公司)反转录为cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3引物设计与合成 TBULC和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TBULC上游引物：5′-GGGGTG AGAGGAACAACAAA-3′，下游引物：5′-TGTCA GGGGAGCCATACAC-3′；GAPDH上游引物：5′-CCT GGTATGACAACGAATTTG-3′，下游引物：5′-CAG TGAGGGTCTCTCTCTTCC-3′。

1.2.4RT-qPCR检测 采用美国Bio-Rad公司生产的T100 梯度PCR仪，按照日本Takara公司生产的SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒说明书进行反应体系配制。采用相对定量PCR的方法计算TBULC的相对表达水平。PCR反应体系共25 μL，其中10 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，荧光混合物10 μL，50×ROX染料0.5 μL，cDNA模板1 μL，双蒸水11.5 μL。上述操作均在冰上进行，加样完成后离心、上机。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，58 ℃退火，延伸30 s，共40个循环。采用公式2-ΔΔCt计算相对表达水平。试验重复5次。

1.2.5血清CEA水平检测 采用罗氏公司生产的Cobas 801电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测各组血清CEA水平。

2 结 果

2.13组血清TBULC、CEA水平比较 LUAD组血清TBULC、CEA水平均明显高于肺良性结节组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肺良性结节组和对照组血清TBULC、CEA水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组血清TBULC、CEA水平比较

2.2LUAD患者手术前后血清TBULC水平比较 LUAD患者术前血清TBULC水平为3.558±0.559，术后为1.951±0.818，术前血清TBULC水平明显高于术后，差异有统计学意义(t=41.463，P<0.05)。

2.3血清TBULC和CEA水平与LUAD患者临床病理特征的关系 肿瘤最大径≥3 cm 的患者TBULC和CEA水平高于<3 cm的患者，TNM Ⅲ～Ⅳ期的患者TBULC和CEA水平高于Ⅰ～Ⅱ期的患者，有淋巴结转移的患者TBULC和CEA水平高于无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。LUAD患者血清TBULC和CEA水平与性别、年龄均无关(P>0.05)。见表2。

表2 LUAD患者血清TBULC和CEA水平与患者临床病理特征的关系

2.4LUAD患者血清TBULC水平与CEA水平的相关性 Pearson相关分析结果显示，LUAD患者血清TBULC水平与CEA水平呈正相关性(r=0.642，P<0.001)。

2.5血清TBULC与CEA对LUAD的诊断效能分析 ROC曲线分析结果显示，TBULC的诊断阈值为2.84，在此阈值处，ROC曲线下面积(AUC)为0.878，灵敏度、特异度分别为98.10%和73.00%，均高于CEA。TBULC与CEA联合检测诊断LUAD的AUC、灵敏度、特异度均高于两项指标单独检测。见表3、图1。

表3 血清TBULC与CEA对LUAD的诊断效能

3 讨 论

LUAD作为常见的呼吸系统恶性肿瘤，其发病率和病死率一直处于较高水平[8-10]，且由于发病隐匿，大部分患者在确诊时已经进入中晚期，导致其5年生存率较低[11-12]，因此，寻找高特异度和灵敏度的肿瘤标志物一直是LUAD临床研究的热点。

本研究结果显示，LUAD组血清TBULC水平明显高于肺良性结节组和对照组(P<0.05)，肺良性结节组和对照组间血清TBULC水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示LUAD患者血清TBULC存在明显高表达，出现该结果的原因可能与TBULC参与了LUAD的发生过程有关。LUAD患者术前血清TBULC水平高于术后，提示TBULC可以作为患者手术治疗效果的观察指标。

此外，本研究还发现肿瘤最大径<3 cm、无淋巴结转移、TNMⅠ～Ⅱ期的LUAD患者血清TBULC水平分别低于肿瘤最大径≥3 cm、有淋巴结转移与TNM Ⅲ～Ⅳ期的患者，提示病情越严重的患者血清TBULC水平越高，考虑可能随着病情加重，TBULC通过相应的信号通路产生了更加明显的生化调节，最终表现出更高的表达水平。ZHENG等[7]研究显示，TBULC在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高表达，并且在体外实验中TBULC通过转化生长因子-β(TGF-β)诱导的上皮间质转化(EMT)途径来促进NSCLC细胞的迁移和转移，推测其可能也通过EMT途径促进了LUAD的迁移和侵袭，但该结论需要进一步的研究验证。在临床工作中通过监测TBULC的表达情况可以有效判断LUAD患者的病情严重程度，进一步为临床治疗方案的制订提供依据。

相关性分析结果显示，LUAD患者血清TBULC水平与CEA水平呈正相关，提示二者在LUAD发生、发展过程中可能存在协同作用。本研究ROC曲线分析结果显示，TBULC与CEA联合检测诊断LUAD的效能高于TBULC、CEA单独检测，二者联合检测提高了诊断效能，有效减少了误诊和漏诊。本研究缺少LUAD患者的随访资料，因此TBULC与LUAD患者预后之间的关系需要在今后的研究中进一步探讨。

综上所述，TBULC与LUAD的发生、发展有关，可作为LUAD治疗效果及病情评估的良好指标，且与CEA联合检测可提高对LUAD的诊断效能。