老年冠心病患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平变化及其与预后的关系*

郝春霞，张晓光，徐锦华，贾明轩，励 国

北京市丰台中西医结合医院急诊科，北京 100072

冠心病(CHD)是临床常见的由冠状动脉粥样硬化造成血管腔狭窄、堵塞，进而引发心肌缺血、缺氧的心血管疾病，多发于老年人群，具有病死率高，预后差的特点，严重威胁患者的生命安全[1]。除了高血压、高血糖、高血脂等易引发冠状动脉粥样硬化的传统危险因素外，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)产生过量活性氧(ROS)引起的氧化应激也与冠状动脉粥样硬化的发生、发展有关[2]。NOX2是NOX的一种亚型，在心力衰竭患者中表达异常，NOX2表达水平降低时可使ROS生成减少，从而改善心力衰竭患者的心功能[3]。NOX4在心力衰竭患者中的表达上调与氧化应激反应水平升高有关，NOX4可能通过影响心肌纤维化和氧化应激程度来影响心力衰竭的发生、发展[4]。目前，NOX2、NOX4在老年CHD患者血清中的水平及与预后的关系报道较少。基于此，本研究通过检测NOX2、NOX4 mRNA在老年CHD患者血清中的水平，并分析其与患者预后的相关性，以期为临床及时诊断、有效评估患者预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2020年1月本院收治的老年CHD患者146例为CHD组，其中男91例，女55例；年龄61～79岁，平均(68.48±6.37)岁。并选取同期体检健康老年人146例为对照组，其中男87例，女59例；年龄60～78岁，平均(68.16±6.25)岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有受试者均自愿参与本研究并签署知情同意书。纳入标准：(1)符合CHD相关诊断标准[5]，且经冠状动脉造影检查确诊者；(2)年龄≥60岁；(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并急、慢性感染或免疫系统疾病；(2)近期发生过脑血管意外、外伤，近期有手术史；(3)合并严重肝肾功能不全、结缔组织病或恶性肿瘤；(4)合并先天性心脏病、肺源性心脏病等；(5)合并脂肪肝、中毒性肝炎等肝脏疾病；(6)合并胆石症、胆囊炎。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂(批号：CD-102523GM)购自武汉纯度生物科技有限公司；QuantiTect Reverse Transcription试剂盒(批号：205314)购自上海浩洋生物科技有限公司；Perfectstart Taqman qPCR master mix实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(批号：TQ2301-01)购自北京智杰方远科技有限公司；人丙二醛(MDA)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(批号：FK-R0433)购自上海樊克生物科技有限公司；人超氧化物歧化酶(SOD)ELISA试剂盒(批号：QN-PS0387)购自上海乔羽生物科技有限公司。Implen超微量紫外分光光度计(型号：NP-80)购自苏州贝锐仪器科技有限公司；RT-qPCR仪(型号：ABI StepOnePlus)购自上海凌仪生物科技有限公司；多功能酶标仪(型号：SpectraMax i3x)购自美谷分子仪器(上海)有限公司。NOX2、NOX4 mRNA引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3方法

1.3.1标本采集及预处理 采集CHD患者入院第2天及体检者体检当天空腹静脉血约6 mL，静置40 min，3 250 r/min离心8 min，分离上层血清，分装，密封保存于-20 ℃冰箱，用于NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平检测。

1.3.2RT-qPCR检测血清NOX2、NOX4 mRNA水平 取出冻存的分装血清标本，无菌环境中解冻，添加适量Trizol试剂，提取总RNA，具体操作步骤参考Trizol试剂说明书。使用紫外分光光度计检测RNA的完整性、浓度及纯度。依照QuantiTect Reverse Transcription试剂盒说明书反转录得到cDNA，扩增cDNA，并进行RT-qPCR检测。NOX2、NOX4 mRNA均以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算NOX2、NOX4 mRNA相对表达水平。

表1 NOX2、NOX4、GAPDH的引物序列

1.3.3ELISA检测血清MDA、SOD水平 检测所有研究对象血清MDA、SOD水平，检测步骤严格参照试剂盒说明书进行。

1.4随访 以入院时间为起点，采用电话或门诊复查的方式进行为期6个月的随访，以患者出现顽固性心绞痛、心源性猝死、心肌梗死、心力衰竭等不良心血管事件为预后不良。

2 结 果

2.1两组血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比较 与对照组相比，CHD组血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平均明显升高(P<0.05)，血清SOD水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 两组血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比较

2.2不同预后老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比较 经过6个月的随访，预后良好患者87例，预后不良患者59例。与预后良好患者相比，预后不良患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平明显升高(P<0.05)，血清SOD水平明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 不同预后老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平比较

2.3老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平与MDA、SOD水平的相关性 Pearson相关性分析结果显示，老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平与MDA水平呈正相关(P<0.05)，与SOD水平呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平与MDA、SOD水平的相关性

2.4老年CHD患者预后的影响因素分析 以老年CHD患者的预后为因变量，以血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平升高为老年CHD患者预后的独立危险因素(P<0.05)，血清SOD水平升高为老年CHD患者预后的独立保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 多因素Logistic回归分析结果

2.5血清NOX2、NOX4 mRNA水平对老年CHD患者不良预后的预测价值 ROC曲线分析结果显示，血清NOX2 mRNA预测老年CHD患者不良预后 的曲线下面积(AUC)为0.822(95%CI:0.745～0.900)，截断值为1.68，灵敏度、特异度分别为72.9%、86.2%。血清NOX4 mRNA水平预测老年CHD患者不良预后的AUC为0.830(95%CI:0.760～0.902)，截断值为1.35，灵敏度、特异度分别为79.9%、74.7%。血清NOX2、NOX4 mRNA联合预测老年CHD患者不良预后的AUC为0.943(95%CI:0.901～0.984)，灵敏度、特异度分别为85.2%、91.8%。见图1。

图1 血清NOX2、NOX4 mRNA预测老年CHD患者不良预后的ROC曲线

3 讨 论

CHD是以动脉粥样硬化为病理基础的一种疾病，可导致患者死亡，对人类健康构成极大威胁[6-8]。因此，寻找有效预测老年CHD患者预后的指标，评估患者病情，对改善CHD患者预后具有重要的临床意义。

NOX是一类具有生成ROS功能的蛋白质，分布于细胞膜上，其产生的ROS在自噬、细胞增殖、凋亡、衰老、抗炎、抗菌及氧化还原信号转导等生物学过程中均起重要作用，已成为抗纤维化、炎症、氧化应激的靶标[9-10]。NOX主要功能是产生过量ROS，而过量的ROS可引起心力衰竭、心律失常、心肌梗死等心血管疾病[11]。有研究发现，NOX2在CHD患者中表达上调，经血府逐瘀汤治疗后，NOX2和ROS表达下调，提示NOX2表达异常可通过影响氧化应激，进而影响CHD的发展过程[12]。还有研究发现，NOX2在高血压患者中呈高表达，α-硫辛酸可降低NOX2的表达水平，抑制氧化应激反应，抑制高血压的发生、发展进程[13]。此外，NOX2在心力衰竭患者中表达异常，经丹参酮ⅡA治疗后，NOX2表达下调，心肌纤维化进程延缓，提示NOX2在心力衰竭患者的心肌纤维化发展过程中发挥重要作用[14]。以上研究均表明，NOX2表达失调与氧化应激参与的心血管疾病密切相关。本研究中CHD组血清NOX2 mRNA水平明显高于对照组，提示NOX2可能在老年CHD的发病过程中发挥一定作用。有研究发现，NOX4在心肌缺血-再灌注时表达上调，经右美托咪定作用后，其表达下调，提示NOX4可能参与并影响心肌缺血-再灌注的发生、发展过程[15]。NOX4在CHD患者外周血中呈高表达，经有氧运动配合放松训练后患者NOX4表达下调，且氧化应激损伤程度有所减轻，NOX4可能在CHD患者发病过程中通过影响氧化应激反应而发挥作用[16]。以上研究表明，NOX4异常表达与CHD发生、发展有关。本研究中CHD组血清NOX4 mRNA水平明显高于对照组，提示NOX4可能参与了CHD的发生。

机体产生过多ROS或清除ROS的能力降低是导致氧化应激反应的主要原因，ROS可引发MDA蓄积，可作为动脉粥样硬化及CHD的标志物[17-18]。MDA在CHD患者血清中水平较高，可能影响CHD的发生、发展过程[19]。SOD可清除体内的ROS，在氧化应激反应中发挥重要作用，且其在CHD患者中水平下降，与CHD发生、发展关系密切[20]。本研究中，CHD组血清MDA水平明显高于对照组，血清SOD水平明显低于对照组，提示MDA、SOD可能参与并影响CHD的发病过程。

本研究发现，预后不良的老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平均明显高于预后良好患者，血清SOD水平明显低于预后良好患者，进一步提示CHD的发生、发展与氧化应激反应有关，及时监控血清NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平，对评估老年CHD患者的预后有一定的临床参考价值。本研究中，老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA水平与MDA水平呈正相关，与SOD水平呈负相关，考虑其具体机制如下：NOX2、NOX4生成ROS，引起氧化应激反应，并与MDA、SOD相互作用，从而共同影响CHD的发生、发展。进一步研究显示，NOX2、NOX4 mRNA及MDA水平升高为老年CHD患者预后的独立危险因素，SOD水平升高为老年CHD患者预后的独立保护因素，提示对NOX2、NOX4 mRNA及MDA、SOD水平进行及时监控，将有助于早期评估老年CHD患者的病情发展情况。血清NOX2、NOX4 mRNA预测老年CHD患者不良预后的AUC分别为0.822、0.830，提示血清NOX2、NOX4 mRNA对老年CHD患者的预后均有一定的预测价值；血清NOX2、NOX4 mRNA联合预测老年CHD患者预后的AUC为0.943，灵敏度为85.2%，特异度为91.8%，提示NOX2、NOX4 mRNA联合预测老年CHD患者预后的价值高于两项单独预测。

综上所述，老年CHD患者血清NOX2、NOX4 mRNA表达上调，二者均可能参与并影响CHD的发生、发展，二者联合检测对老年CHD患者的预后具有较高的预测价值。