两种非衍生化串联质谱法检测试剂在遗传代谢病筛查中的性能比较及应用评价*

张万巧，韦秀娟，闫 磊，杨 晓，陈雨晗

中国人民解放军总医院儿科医学部/中国人民解放军总医院第七医学中心儿科研究所/出生缺陷防控关键技术国家工程实验室/儿童器官功能衰竭北京市重点实验室，北京 100700

遗传代谢病(IMD)是由遗传缺陷引起的包括生化代谢相关酶、受体及细胞膜功能异常在内的一大类疾病的总称[1]，其可于出生后数小时或数天内起病，起病隐匿，临床表现无特异性，常出现漏诊、误诊[2]。在造成不可逆的神经系统损害前进行新生儿筛查，实现及时诊断、正确干预，对降低IMD致残率，挽救患儿生命有重要意义[3]。新生儿筛查最早实施于1960年，被证实是最成功的公共卫生项目之一，并在全世界多个国家广泛推行[4-5]。串联质谱技术能分析干血斑中数十种氨基酸(AA)和酰基肉碱(AC)，能快速、简便、高通量地筛查包括AA、有机酸及脂肪酸代谢异常在内的约45种IMD，是目前常用的新生儿IMD筛查技术[6-7]。最初，串联质谱技术的标本前处理多运用衍生化方法，而现阶段耗时更短、环境污染更小的非衍生化方法逐渐成为主流[8-9]。当前IMD筛查实验室采用的非衍生化试剂种类繁多，对于这些试剂的性能特征、质量管理尚无明确标准[10-11]。关于非衍生化筛查系统的性能研究多以Xevo TQD串联质谱仪及配套的Neobase试剂盒作为研究对象，且已有文献证实该筛查系统性能稳定，可按照常规临床化学检验系统的相关标准进行管理[8,12]。为了对在Xevo TQD串联质谱仪上采用NSK试剂建立的IMD筛查系统进行方法学评估及临床检测分析，本研究在同一串联质谱检测平台上，以Neobase试剂盒为参照，同时对两种试剂的检测准确性、精密度、稳定性和临床检测效能进行评价，以验证NSK试剂的分析性能是否满足临床需求。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究所涉及标本均为滤纸干血斑，包括中华人民共和国国家卫生健康委员会临床检验中心(以下简称国家临床检验中心)2020年全国第1次新生儿IMD串联质谱筛查AA和AC室间质量评价标本，杭州宝荣科技有限公司生产的新生儿筛查血斑质控品(AA、AC)及中国人民解放军总医院收治的住院新生儿的足底血标本和实验室保存的患儿足底血标本。所有标本均于4 ℃保存。住院新生儿足底血标本共150份，未经过IMD筛查，检测结果未知。实验室保存的患儿足底血标本20份均经过IMD筛查，其中IMD阴性3份、阳性17份。17份阳性标本中检出高苯丙氨酸血症(HPA)3份、甲基丙二酸血症5份、丙酸血症1份、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症(OTCD)2份、瓜氨酸血症(CTLN)2份、枫糖尿症1份、戊二酸血症1份、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症1份及短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症1份。

1.2仪器与试剂 Xevo TQD串联质谱仪、Binary HPLC Pump 1525二元高效液相泵、 2777C自动进样器均购自美国Waters公司；MB100-4A微孔板恒温振荡器购自杭州奥盛科技有限公司；Neobase试剂盒(非衍生化串联质谱法多种AA、肉碱和琥珀酰丙酮测定)购自美国Perkin Elmer公司；高纯氩气和高纯氮气(99.999%，Air products)、AA同位素内标NSK-A、游离肉碱和AC同位素内标NSK-B均购自美国Cambridge Isotope Laboratories公司;色谱级甲醇、甲酸购自美国Fisher Scientific公司。

1.3方法

1.3.1非衍生化方法 分别取内标NSK-A、NSK-B各1瓶，用1 mL甲醇超声溶解45 min，然后混匀作为工作母液；工作母液用甲醇水溶液按照1∶100的比例稀释，作为工作液。每份滤纸干血片上用打孔器取1个直径约3.2 mm的血斑，置于96孔板中，再加入工作液100 μL；将板密封后，40 ℃振荡孵育45 min；取上清液85 μL转移至新的96孔板，再加入100 μL流动相，铝箔覆盖后上机检测。上述前处理步骤适用于NSK试剂，Neobase试剂盒标本前处理方法参见试剂盒说明书。NSK试剂工作母液及Neobase试剂盒中的内标均于4 ℃保存。

1.3.2质谱方法系数校正 对NSK试剂及Neobase试剂盒在同一台Xevo TQD串联质谱仪上建立数据采集的多反应监测方法文件。两种试剂均采用与Neobase试剂盒批次匹配的质控品(低、高水平)进行5次以上的重复检测，并将各分析物的检测结果与质控证书上的水平赋值进行比较。按照中国医师协会检验分会临床质谱检验专业委员会推荐的偏倚范围对方法系数进行校正，保证两种试剂的各项目检测值都在允许范围内[13]。

1.3.3参考切值的确立 考虑到采用两种试剂检测时前处理反应原理、分析仪器及分析标本的一致性，且各项目检测值都溯源到Neobase试剂盒配套质控品，因此两种试剂均采用Neobase试剂盒说明书建议的各项目切值作为参考切值[14]。

1.3.4性能验证 在实验前对检测系统进行维护，确认各设备处于良好的运行状态，用同一批NSK试剂和Neobase试剂盒进行性能验证。(1)准确性验证：对国家临床检验中心2020年全国第1次新生儿IMD串联质谱筛查AA和AC室间质量评价标本进行检测，依据该质量评价计划的分组及评价方法[15-16]对所得结果进行分析和对比。(2)精密度验证：检测低、中、高3个水平的质控品，计算AA各项目[丙氨酸(ALA)、精氨酸(ARG)、瓜氨酸(CIT)、甘氨酸(GLY)、亮氨酸(LEU)、蛋氨酸(MET)、鸟氨酸(ORN)、苯丙氨酸(PHE)、脯氨酸(PRO)、酪氨酸(TYR)、缬氨酸(VAL)]和AC各项目[游离肉碱(C0)、乙酰肉碱(C2)、丙酰肉碱(C3)、丁酰肉碱(C4)、羟基异戊酰肉碱(C5OH)、异戊酰肉碱(C5)、戊二酰肉碱(C5DC)、己酰肉碱(C6)、辛酰肉碱(C8)、癸酰肉碱(C10)、十二酰肉碱(C12)、十四酰肉碱(C14)、十六酰肉碱(C16)、十八酰肉碱(C18)]的批内精密度；在3个工作日内重复上述实验3次，计算AA、AC各项目的批间精密度。(3)稳定性验证：在NSK试剂及Neobase试剂盒启用第1天、第15天、第28天，分别对低、中、高3个水平质控品各打孔3个血斑进行检测，计算AA、AC各项目检测当天检测值的均值，并进行比较。(4)临床标本检测性能验证：将住院新生儿足底血标本150份及实验室保存的患儿足底血标本20份分批在NSK试剂及Neobase试剂盒启用第3天、第15天和第28天进行检测；标本IMD筛查结果根据已确立的参考切值进行判断，比较所有标本经两种试剂检测后的结果。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料两组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1NSK试剂和Neobase试剂盒的差异比较 NSK试剂和Neobase试剂盒的主要差异见表1。NSK试剂中包含12种AA的同位素内标，而Neobase试剂盒中包含11种，两种试剂10种内标的AA种类相同。NSK试剂特有的AA内标为氘代天冬氨酸(2H3-ASP)和氘代谷氨酸(2H3-GLU)，Neobase试剂盒特有的AA内标为碳十三代脯氨酸(13C5-PRO)。对于AC类内标，NSK试剂包含8种，而Neobase试剂盒包含13种，其相较NSK试剂增加了氘代戊二酰肉碱(2H6-C5DC)、氘代己酰肉碱(2H3-C6)、氘代癸酰肉碱(2H3-C10)、氘代十二酰肉碱(2H3-C12)、氘代十八酰肉碱(2H3-C18)。虽然二者涉及的AC检测项目相同(都是31种)，但是在13种中链和长链项目[戊二酰肉碱+羟基己酰肉碱(C5DC+C6OH)、C6、己二酰肉碱(C6DC)、C10、癸烯酰肉碱(C10∶1)、癸二烯酰肉碱(C10∶2)、C12、十二烯酰肉碱(C12∶1)、C18、十八烯酰肉碱(C18∶1)、羟基十八烯酰肉碱(C18∶1OH)、十八碳二烯酰肉碱(C18∶2)、羟基十八酰肉碱(C18OH)]的检测中使用的内标不同。另外，Neobase试剂盒还包含检测琥珀酰丙酮(SA)的内标。

表1 NSK试剂和Neobase试剂盒的主要差异

2.2准确性验证结果 国家临床检验中心2020年全国第1次新生儿IMD串联质谱筛查AA和AC室间质量评价计划包括8种AA和15种AC，共23项，每项有5个批号的质控标本。按照国家临床检验中心设定的分组原则、各项目靶值及评价方法，本研究NSK试剂检测的23个项目中，质控合格的(测定成绩≥80%)有21项，不合格的项目为TYR(测定成绩为60%)和C10(测定成绩为25%)，测定成绩达100%的项目占82.6%(19/23)。Neobase试剂盒检测的23个项目全部合格，测定成绩达100%的项目占78.3%(18/23)。

2.3精密度验证结果 对于AA各项目，NSK试剂检测的批内精密度为0.22%～13.02%(均值为5.82%)，批间精密度为6.83%～14.35%(均值为10.19%)；Neobase试剂盒检测的批内精密度为0.11%～8.63%(均值为3.88%)，批间精密度为3.45%～7.29%(均值为5.45%)。对于AC各项目，NSK试剂检测的批内精密度为0.84%～18.90%(均值为8.33%)，批间精密度为8.37%～28.78%(均值为15.17%)；Neobase试剂盒检测的批内精密度为0.57%～12.88%(均值为5.73%)，批间精密度为4.39%～18.49%(均值为9.10%)。Neobase试剂盒检测C5OH、C5DC、C6低水平标本和C14高水平标本的批内精密度>10.00%，而检测其余项目低、中、高水平标本的批内和批间精密度均优于NSK试剂。NSK试剂检测AA 6个项目(ALA、LEU、ORN、PHE、PRO、VAL)中水平标本的批内精密度存在较大偏差，而检测AC时有7个中、长链项目(C5OH、C5、C5DC、C6、C10、C16、C18)多于两个水平的精密度存在较大偏差(批内精密度>10.00%，批间精密度>15.00%)，精密度验证结果差于Neobase试剂盒。

2.4稳定性验证结果 在11个AA项目中，启用第15天，两种试剂在中、高水平质控品检测中表现出良好的稳定性[启用第1天与第15天的检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)]；而在低水平质控品检测中，两种试剂都有项目出现检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Neobase试剂盒启用第1天和第28天，检测中水平ALA、ARG、ORN、VAL，高水平ALA的结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)；NSK试剂启用第1天和第28天，检测高水平ALA、CIT、PRO、TYR的结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。在14个AC项目中，启用第15天，两种试剂在中、高水平质控品检测中表现出良好的稳定性[启用第1天与第15天的检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)]；而在低水平质控品检测中，两种试剂都有项目出现检测结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。Neobase试剂盒启用第1天和第28天，检测中水平C0、C2、C5OH、C5、C12、C14，高水平C2、C5DC、C6、C14的结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)；NSK试剂启用第1天和第28天，检测高水平C2、C5DC、C14的结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 AA各项目稳定性验证结果(P)

表3 AC各项目稳定性验证结果(P)

2.5临床标本检测性能验证结果 针对筛查结果未知的150份住院新生儿足底血标本，NSK试剂和Neobase试剂盒在启用第3天、第15天、第28天均对同一份标本检出HPA阳性，对其余149份标本检测结果为阴性。在20份实验室保存的患儿足底血标本中，针对已确证IMD阴性的3份标本，两种试剂在启用第3天、第15天、第28天均检测出阴性结果；针对已确证为IMD阳性的17份标本，两种试剂在启用第3天、第15天、第28天的检测结果与确证结果相符。

3 讨 论

本研究在同一串联质谱检测平台上，同时对用NSK试剂构建的筛查系统和配套的Neobase试剂盒筛查系统从准确性、精密度、稳定性和临床标本检测性能4个方面进行对比和评价，以期为临床应用提供参考。

本研究对NSK试剂和Neobase试剂盒的主要成分进行分析发现，NSK试剂特有的AA内标2H3-ASP和2H3-GLU，分别对应检测项目ASP和GLU。ASP是筛查CTLN Ⅰ型的一级指标，GLU是筛查N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症的一级指标以及筛查OTCD和氨甲酰基磷酸合成酶缺乏症的二级指标。Neobase试剂盒特有的AA内标13C5-PRO对应检测项目PRO，是筛查高脯氨酸血症的一级指标；其还可额外检测SA，SA是筛查酪氨酸血症Ⅰ型的二级指标。因此，对于AA代谢异常类IMD的筛查，两种试剂在检测范围上各有所长。对于AC类项目，相较于NSK试剂，Neobase试剂盒增加了内标2H6-C5DC、2H3-C6、2H3-C10、2H3-C12、2H3-C18，因此，在13种中、长链项目的检测上，Neobase试剂盒使用的内标理化性质(碳链长度)更接近被检测物，理论上具有更准确的定量检测结果。

本研究的准确性验证中，检测C10时Neobase试剂盒达标而NSK试剂未达标，可能与Neobase试剂盒使用2H3-C10内标而NSK试剂使用的是氘代十四酰肉碱(2H3-C14)内标相关。而检测TYR时两种试剂所用内标相同，都是碳十三代酪氨酸(13C6-TYR)，但NSK试剂检测时未达标，考虑与前处理操作方法有关，使用NSK试剂时，血片提取液经流动相稀释后再上样，省去了V型底96孔板的使用；而使用Neobase试剂盒则是将血片提取液移入V型底96孔板中直接进样。本研究中，NSK试剂的前处理方法虽然节省了对V型底96孔板的使用，但稀释血片提取液可造成内标及待测物水平降低、上样不均一，从而导致检测准确度、精密度下降。在精密度验证中，不同检测项目的精密度偏倚范围相差较大，即使同一检测项目其低、中、高水平的检测偏倚程度也无规律可循，与已有报道类似[8,12]，推测与各检测项目所对应的同位素内标的稳定性各不相同有关。本研究发现，在AC 7个中、长链项目的检测精密度上，Neobase试剂盒的表现普遍优于NSK试剂，这可能与前面提到的内标选择相关。在稳定性验证中，启用第1天与第15天的检测结果比较显示，两种试剂对各项目低水平质控品的检测稳定性低于中、高水平，考虑可能与低水平质控品易降解及其检测易受基质干扰有关。两种试剂在启用第15天时，对各项目中、高水平质控品的检测均表现出良好的稳定性，而在启用第28天时有部分项目出现检测稳定性不佳的情况，特别是ALA、C2、C5DC、C14，考虑与上述项目所对应内标降解的快慢程度相关。后续研究为提高NSK试剂筛查的准确性和精密度，可考虑增加其内标种类，并采取血片提取液直接上样的方式。在临床标本检测性能验证中，针对筛查结果未知的150例新生儿足底血标本及已确证筛查结果的20份患儿足底血标本，两种试剂所得筛查结果完全一致，且与已确证结果相符，证明本实验室构建的NSK试剂筛查系统具有与Neobase试剂盒筛查系统一致的临床标本检测性能。

本研究首次对利用NSK试剂构建的非衍生化串联质谱法IMD筛查系统进行临床性能验证和评价。对比配套的Neobase试剂盒，NSK试剂虽在检测准确性、精密度上稍有不足，但在稳定性上与Neobase试剂盒表现类似，且二者在临床应用中检测结果一致。在改进非衍生化串联质谱法IMD筛查系统的检测质量上，本研究结果提示：(1)选取稳定性更高、理化性质更接近被测物(目标检测物的同位素)的内标可提高检测精密度和准确性；(2)通过增加内标种类来增加检测项目，从而增加系统的筛查病种，提高疾病检出率；(3)前处理后上机的血片提取液应控制合适的体积范围，避免因内标或被测物过度稀释导致检测精密度、准确性下降。