SIRT3过表达抑制肝癌细胞的迁移与侵袭*

宋春丽，张 琰，周义文

南方医科大学深圳医院临床检验医学中心,广东深圳 518100

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，其起病隐匿、进展迅速、恶性程度高、病死率高[1]。sirtuin蛋白家族是近年来发现的一类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖的组蛋白去乙酰化酶，包括沉默信息调节因子(SIRT)1～SIRT7。其中，SIRT3是线粒体内主要的去乙酰化酶，其在被线粒体基质加工肽酶切割后活化，全长SIRT3驻留在细胞核中，在相关因素(例如DNA损伤)影响下，SIRT3会迁移到线粒体内。SIRT3目前已知的功能包括参与细胞凋亡、能量代谢、热量限制、氧化应激等[2-6]。近年来，关于SIRT3在肿瘤发生、发展中的作用受到越来越多的关注。本研究在肝癌细胞株Huh-7中转染pc-DNA3.1质粒(对照)及SIRT3质粒，用细胞划痕实验和细胞侵袭实验来探索SIRT3基因过表达对肝癌细胞迁移能力和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料来源 人肝癌细胞株Huh-7来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

1.2仪器与试剂 蛋白质印迹法(Western blot)电泳仪、电转膜仪、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)扩增仪均购自美国伯乐公司；高速低温离心机购自德国艾本德股份有限公司；酶标仪购自美国Genecopoeia公司；DMEM培养基、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、青链霉素双抗购自美国赛默飞世尔公司；对照pc-DNA3.1质粒、构建在载体pc-DNA3.1上的SIRT3质粒购自美国Addgene公司；SIRT3引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；SYBR Green PCR反应混合液购自瑞士Roche公司；反转录PCR试剂盒购自美国伯乐公司；蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；SIRT3抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自美国GE公司；Transwell小室购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养 人肝癌细胞株Huh-7培养于10%高糖DMEM培养基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，待细胞长满培养皿的80%后进行传代，接种于6孔板中，每孔约8×104个细胞;于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用对照pc-DNA3.1质粒转染Huh-7细胞(对照组)，用SIRT3质粒转染Huh-7细胞(实验组)，24 h后换液，转染72 h后两组均进行RT-qPCR和Western blot检测。

1.3.2RT-qPCR检测SIRT3 mRNA表达水平 提取细胞总RNA，以随机引物进行反转录合成cDNA，于-20 ℃下保存。取1.0 μL cDNA，SIRT3上、下游引物各0.2 μL及 5.0 μL SYBR Green PCR反应混合液，并补充去RNA酶水3.6 μL构建成10.0 μL反应体系，进行定量PCR扩增。扩增条件:95 ℃ 2 min(预变性)、94 ℃ 20 s(变性)、60 ℃ 20 s(退火)、72 ℃ 20 s(延伸)、72 ℃ 1 s，34个循环。采用RT-qPCR扩增仪进行SIRT3相对定量分析，SIRT3上游引物：5′-ATCGATGGGCTTGAGAGAGT-3′，下游引物：5′-AGGTTCCATGAGCTTCAACC-3′。β-actin 上游引物：5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，下游引物:5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′ 。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算 SIRT3相对表达水平。实验组和对照组分别取3管细胞标本进行检测，每管重复检测3次，检测结果取平均值。

1.3.3Western blot 检测SIRT3蛋白表达水平 收集实验组和对照组细胞，冰浴、摇床摇30 min充分裂解后离心，分离出待测蛋白。取30 μg待测蛋白标本经8% SDS-PAGE电泳，移至NC膜；5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗SIRT3抗体(1∶3 000),4 ℃摇床孵育12 h，洗膜3次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶标二抗(1∶3 000)，室温孵育2 h，洗膜3次，每次5 min；混合发光底物作用1 min，将NC膜覆于保鲜膜下，暗箱中显影曝光。用相同方法检测β-actin作为内参，实验重复3次。

1.3.4细胞划痕实验检测Huh-7细胞的迁移能力 实验组与对照组转染72 h后用10 μL枪头垂直于培养板中线，比着直尺划线，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3次，加入DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，通过在显微镜下观察划痕两侧细胞的距离来比较Huh-7细胞迁移情况。

1.3.5细胞侵袭实验检测Huh-7细胞的侵袭能力 实验组与对照组转染24 h后用胰酶消化，上室(包被Matrigel碳酸酯滤膜，滤膜孔径为8 μm)每孔分别加入含Huh-7细胞2×104个的DMEM培养基(无血清)500 μL，下室加入DMEM培养基(含10%胎牛血清)700 μL，孵育条件为5% CO2、37 ℃、10 h。轻轻擦去上室滤膜未侵袭细胞，固定后用0.1%结晶紫染色40 min，清洗后晾干，20倍倒置显微镜下随机选取两组5个不同视野统计细胞侵袭数量，取其平均值，实验重复3次。

2 结 果

2.1两组SIRT3 mRNA表达水平比较 与对照组相比，实验组SIRT3 mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)，实验组SIRT3质粒在Huh-7细胞中转染成功。见图1。

注：与对照组比较，*P<0.001。图1 RT-qPCR检测SIRT3 mRNA表达水平

2.2两组SIRT3蛋白表达水平比较 与对照组相比，实验组SIRT3蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 Western blot检测SIRT3蛋白表达水平

2.3细胞划痕实验检测Huh-7细胞的迁移能力 划痕48 h时，对照组两侧边缘的细胞已向中间明显迁移，两侧细胞间距离明显缩短，边缘参差不齐，迁移痕迹较重，而实验组两侧边缘细胞也有缓慢迁移的迹象，但两侧细胞间的距离明显宽于对照组，迁移距离较短。见图3。

图3 细胞划痕实验检测Huh-7细胞的迁移能力

2.4细胞侵袭实验检测Huh-7细胞的侵袭能力 两组细胞接种于上室10 h后收集，显微镜下计数，对照组每个视野为(45±5)个细胞，实验组每个视野为(25±2)个细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 细胞侵袭实验检测Huh-7细胞的侵袭能力

3 讨 论

SIRT3是一种去乙酰化酶，在肝脏、心脏和褐色脂肪组织等代谢活跃的部位高表达。鉴于目前越来越多的研究将肿瘤定义为代谢性疾病，而线粒体又与代谢密切相关，SIRT3作为线粒体内主要的去乙酰化酶，猜测其必然与肿瘤代谢有着一定联系。SIRT3可以通过调控多种细胞代谢通路影响肿瘤细胞的代谢和生长。SIRT3在一些肿瘤中发挥促进肿瘤生长的作用，如SIRT3可以保护宫颈癌细胞免受基因毒性和氧化应激介导的细胞坏死，还可以通过去乙酰化Ku70，增加Ku70与Bcl-2相关X蛋白(BAX)的结合，防止BAX在线粒体易位和应激条件下引起细胞凋亡[7]；SIRT3还可使丝氨酸羟甲基转移酶2脱乙酰化，从而促进结直肠癌的发生[8]。SIRT3在其他一些肿瘤中则发挥抑制肿瘤生长的作用，如SIRT3在骨肉瘤中通过调节活性氧和缺氧诱导因子-1α发挥抑癌基因的作用[9]；此外，其还可以通过微小RNA-708-5p抑制胰腺癌的进展[10]。本课题组在前期研究中发现，SIRT3在肝癌中表达水平明显降低，其对肝癌细胞的增殖起抑制作用，并且可以通过糖原合成酶激酶-3β/BAX途径诱导肝癌细胞凋亡[11]。此外，本课题组还发现，SIRT3通过调节P53途径来诱导肝癌细胞老化[12]。

迁移和侵袭是恶性肿瘤的重要生物学特征。sirtuin蛋白家族中的一些成员也陆续被发现有影响肿瘤迁移和侵袭的能力，比如SIRT5通过调节乙酰辅酶A乙酰转移酶1促进前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[13]；SIRT6通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2-基质金属蛋白酶9(MMP9)途径促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[14]；SIRT7通过激活ERK/信号传导与转录激活因子3信号通路促进神经胶质瘤细胞的增殖和侵袭[15]，其还可以通过抑制E-钙黏蛋白促进结直肠癌细胞的增殖和侵袭[16]。SIRT3与肿瘤侵袭、迁移的关系也有较多报道，如其通过调节脂肪酸合酶促进宫颈癌细胞的侵袭和转移[17]；通过缺氧诱导因子-1α/磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1/丙酮酸脱羟酶E1α亚蛋白抑制胆管癌的发生[18]。因此，sirtuin蛋白家族成员在不同的肿瘤组织中有不同的功能，而且同一成员在不同肿瘤中的功能也有明显差异，说明sirtuin家族成员的功能具有细胞和肿瘤特异性。

本研究初步探讨了SIRT3对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。与对照组相比，实验组SIRT3 mRNA、蛋白的表达水平明显升高，提示SIRT3过表达的肝癌细胞模型构建成功，进一步通过细胞划痕实验和细胞侵袭实验分析过表达SIRT3对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。细胞划痕实验结果显示，48 h时实验组两侧细胞间的距离明显宽于对照组，说明SRIT3过表达抑制了肝癌细胞的迁移能力。细胞侵袭实验结果显示，实验组穿膜细胞数明显少于对照组，表明高表达SIRT3的肝癌细胞侵袭能力受到抑制，但目前关于高表达SIRT3抑制肝癌细胞迁移、侵袭能力的具体分子机制尚不明确，这也将成为本课题组接下来的研究方向。

综上所述，SIRT3与肝癌的发生、发展密切相关，SIRT3的高表达可以抑制肝癌细胞的迁移与侵袭，其有望为肝癌个体化治疗和抗肿瘤药物的开发提供新的方向。