广泛耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶耐药基因分析

郑 琳，张帮林，李 萌，顾成武

1.四川省泸州市中医医院检验科，四川泸州 646000；2.四川省遂宁市中心医院神经内科，四川遂宁 629000

近年来，鲍曼不动杆菌(Ab)感染不断增多，且随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的广泛使用，全球各地陆续出现多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAb)或广泛耐药鲍曼不动杆菌(XDRAb)感染的报道。KARAMPATAKIS等[1]发现，Ab亚胺培南耐药菌株分离率从2017年的27.6%增长至2018年的31.0%。国内王宇航等[2]近年来的研究发现，桂林地区Ab对多种类型抗菌药物，如广谱青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类呈现高度耐药及严重的多重耐药现状，耐药率高于60%。Ab的耐药机制复杂，产β-内酰胺酶是其耐药的主要机制，β-内酰胺酶根据水解对象不同可分为青霉素酶(OXA)、头孢菌素酶(AmpC)、金属类β-内酰胺酶(MBLs)和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)4种。随着临床β-内酰胺类抗菌药物的广泛应用、耐药率的不断上升，以及新的β-内酰胺类抗菌药物的不断开发，对β-内酰胺酶耐药基因的研究越来越受到重视[3]。本研究通过探讨Ab的耐药情况及XDRAb β-内酰胺酶耐药基因的主要分布情况，以期为临床预防和治疗XDRAb感染提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选取泸州市中医医院(以下称本院)临床送检标本中分离的102株Ab(非重复菌株)，所有菌株经法国生物梅里埃公司生产的VITEK2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定确认，其中来自ICU的有44株(43.14%)，心胸外科17株(16.67%)，烧伤科12株(11.76%)，骨伤科14株(13.73%)，呼吸内科8株(7.84%)，神经内科3株(2.94%)，泌尿外科2株(1.96%)，新生儿科1株(0.98%)，妇产科1株(0.98%)；来自痰液标本62株(60.78%)，脓液标本20株(19.61%)，血液标本8株(7.84%)，脑脊液标本3株(2.94%)，伤口分泌物标本3株(2.94%)，尿液标本2株(1.96%)，引流液标本2株(1.96%)，穿刺液标本2株(1.96%)。质控菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603(产ESBLs株)购自中华人民共和国国家卫生健康委员会临床检验中心。肺炎克雷伯菌(IMP-4基因阳性菌株)由本院微生物室提供，已鉴定并测序。

1.2仪器与试剂 主要仪器：VITEK2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏分析仪，PCR扩增仪，低温离心机，金属浴加热仪，35 ℃恒温孵育箱，琼脂糖凝胶电泳仪，-80 ℃和-20 ℃冰箱，高压灭菌锅，PCR 96孔反应板，10 μL、100 μL、1 000 μL加样枪和枪头，2.0 mL EP管等。主要试剂：Takara PreMix Taq购自日本Takara公司,DNA MarkerⅡ购自天根生化科技(北京)有限公司,31种引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1药敏试验 临床常用抗菌药物(米诺环素除外)采用VITEK2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏分析仪高通量测序技术检测，分析敏感、中介及耐药率。头孢哌酮/舒巴坦(SCF105)、米诺环素(MH30)、替加环素(TGC15)、多黏菌素E(CT10)采用纸片扩散(K-B)法检测，量取药物抑菌环直径，结果按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)相关标准进行判读 (CLSI未提供头孢哌酮/舒巴坦的K-B法判读标准，故其按照头孢哌酮的标准进行判读)。

1.3.2DNA模板制备 采用煮沸法，将细菌在麦康凯培养基上复苏培养12 h，用棉签挑取适量菌落于2.0 mL EP管中(预先加入1.5 mL生理盐水)，12 000 r/min离心2 min，去除部分上清，混匀，100 ℃煮沸20 min，12 000 r/min低温离心10 min，所得上清液即为所需DNA模板液。

1.3.3DNA PCR扩增 细菌DNA与引物进行PCR扩增，各种靶基因PCR扩增体系均为正向引物、反向引物各1 μL(10 mmol/L)，Takara PreMix Taq 10 μL，超纯水5 μL，模板液3 μL，总反应体积20 μL。PCR反应参数如下：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循环35次，最终72 ℃延伸5 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在紫外凝胶成像仪下观察、记录并拍照。部分基因引物序列见表1。

表1 部分基因引物序列

续表1 部分基因引物序列

1.4统计学处理 采用Excel 2010进行数据统计与分析。

2 结 果

2.1药敏试验结果 分离的102株Ab对临床常用的抗菌药物中除米诺环素的耐药率较低(32.35%)外，对其他抗菌药物的耐药率均较高，为XDRAb菌株。其中亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为74.51%和70.59%；对氨苄西林、呋喃妥因、头孢唑啉和头孢替坦为全耐药；对替加环素耐药率较低，为7.84%。多黏菌素E因无K-B法的CLSI判读标准，故根据抑菌环直径来判断耐药性，其抑菌环直径97.06%在11～17 mm，耐药率低。见表2。

表2 药敏试验结果

续表2 药敏试验结果

2.2β-内酰胺酶耐药基因检测结果 OXA基因中，OXA-20、23、24、51阳性率分别为4.90%、58.82%、24.51%、76.47%，插入序列ISA-OXA-23和ISA-OXA-51阳性率分别为63.73%和21.57%，未检测出OXA-58基因。ESBLs基因中，TEM阳性率较高，为76.47%，SHV阳性率低，为9.80%。AmpC基因中，ADC阳性率较高，为85.29%，DHA阳性率较低，为23.53%。MBLs基因中,IMP-4和VIM阳性率分别为18.63%和20.59%，CTX-M1阳性率为11.76%，PER和GES阳性率低，均为6.86%，Ⅰ类整合基因INT-1阳性率为11.76%。其余MBLs基因CTX-M2、CTX-M8、CTX-M9、CTX-M25、KPC、VEB、CARB、LAP、SCO、SIM、SPM、GIM、AIM、NDM均未检出。存在3种以上不同类型基因阳性的菌株有76株，占74.51%。见表3。

表3 β-内酰胺酶耐药基因阳性率分布

3 讨 论

Ab是引起医院感染的病原菌之一，可引起呼吸道、血液、泌尿道、伤口等多部位感染，有较高的病死率[4-5]。Ab耐药率高，耐药性强，同时耐药性可克隆传播,临床治疗较为困难[6-7]。本研究62株Ab来自痰液标本，占60.78%。丁丹[8]连续7年的监测结果显示，Ab以感染下呼吸道为主(76.00%)。结合本研究结果，提示Ab最常见的感染部位为呼吸道。药敏试验结果显示，本院分离到的Ab耐药率高，且耐药广泛，对氨苄西林、呋喃妥因、头孢唑啉和头孢替坦为全耐药，对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦的耐药率分别为74.51%、71.57%和70.59%，为XDRAb菌株。出现该结果可能与抗菌药物的广泛应用和Ab的耐药机制复杂密切相关[9-10]。基因检测结果显示，XDRAb的β-内酰胺酶耐药基因分布较广，以TEM、OXA-23、OXA-51及ADC为主，表明本院分离的XDRAb对β-内酰胺类抗菌药物耐药主要与TEM、OXA-23、OXA-51及ADC基因表达有关。本研究也检测到以往检出率较低的MBLs基因中的IMP-4和VIM，阳性率分别为18.63%和20.59%。本研究3种以上不同类型基因阳性的菌株有76株，占74.51%，故认为本院分离的XDRAb耐药与同时携带多种耐药基因也有关。本研究根据IMP阳性质控菌株与PCR扩增产物电泳条带分析，检出IMP的19株Ab均为IMP-4阳性，但电泳条带显示某些菌株还存在其他长度的IMP基因型，可能为IMP基因的某种亚型，有待进一步对产物进行测序分析。另外，某些菌株OXA-23和ISA-OXA-23的电泳结果中除目的产物外，还出现1或2个条带，但根据设计引物的产物长度，这些条带显示出与目的产物相差较大，可能是由于引物设计的特异度不高导致非特异性扩增所致，也可能是OXA-23的变异产物，结果有待进一步分析及研究验证。

近年来，由于广谱抗菌药物的广泛使用，由Ab引起的医院感染逐年增多，该菌的分离率及耐药率也呈逐年上升趋势[11]，Ab感染已成为难以治疗和控制的院内获得性感染类型[12]。本院分离的XDRAb耐药严重，对抗菌药物敏感率低，其β-内酰胺酶耐药基因分布较广泛，常见耐药基因阳性率高，且同时携带多种β-内酰胺酶耐药基因。了解XDRAb感染的危险因素，研究其耐药机制，对防治XDRAb感染及减少医院感染、交叉耐药尤为重要。

综上所述，本院分离的Ab为XDRAb菌株，β-内酰胺酶耐药基因分布较广泛，存在耐药基因TEM、OXA-23、OXA-51、ADC等是其耐药的主要原因，医院应加强对XDRAb感染的防控，减少医院交叉感染。