红细胞免疫指标在老年股骨粗隆间骨折患者术后肺炎发生中的应用价值*

李韶华，杜慧杰，张进一，常建设，李瑞峰，银晓永

冀中能源峰峰集团有限公司总医院:1.检验科;2.药剂科;3.呼吸科;4.心内科;5.胸外科;6.骨科,河北邯郸 056000

股骨粗隆间骨折是骨质疏松症严重的并发症，好发于老年人群，骨折后应激反应引起的生理变化、骨折断端失血及手术创伤严重影响患者的免疫状态及自身稳态[1]，再加之多数老年患者合并基础疾病，从而增加了肺炎的发病风险。BOHL等[2]的回顾性研究发现，髋部骨折术后30 d内患者肺炎发生率为4.1%，而并发肺炎的患者病死率明显升高。因此，寻找早期诊断肺炎的有效指标，采取有效的治疗措施，对降低肺炎病死率具有重要价值。目前，临床常用的肺炎诊断指标包括白细胞计数(WBC)、红细胞沉降率(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原等，然而发生股骨粗隆间骨折的老年患者在围术期由于创伤、失血、免疫水平低下等原因使上述指标灵敏度、特异度下降。红细胞保留了与各种炎症分子结合和相互作用的能力，可调节免疫反应，如宿主血红蛋白(Hb)可被细菌的胞外蛋白酶激活，释放杀菌活性氧，同时Hb还可通过细胞因子增加巨噬细胞与细菌的结合[3]。基于上述机制，有学者提出可将红细胞补体受体1(ECR1)用于围术期患者免疫水平监测、院内感染性疾病诊断等方面[4-5]。本研究探讨了红细胞免疫指标在老年股骨粗隆间骨折患者术后肺炎发生中的应用价值，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年6月至2020年6月本院骨科收治的老年股骨粗隆间骨折患者770例为研究对象，回顾性分析患者的临床资料，将术后发生肺炎的46例患者纳入肺炎组，未发生其他任何感染的724例患者纳入对照组。纳入标准：(1)年龄>60岁；(2)首次发生股骨粗隆间骨折；(3)接受人工髋关节置换术或内固定术治疗；(4)临床资料完整；(5)手术治疗顺利。排除标准：(1)术前已合并肺炎、其他感染性疾病或急性疾病；(2)术前合并肿瘤等其他严重消耗性疾病；(3)近半年内接受过免疫抑制剂治疗。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 全自动FACS CantoTMⅡ流式细胞仪、ECR1(CD35)检测试剂、ECR1(CD35)FITC荧光抗体、同型对照IgG1-FITC抗体均购自美国BD公司，分析软件为BD FACSDivaTM；校准微球、磷酸盐缓冲液(PBS)购自德国欧蒙公司；红细胞补体受体1花环率(ECR1-RR)试剂盒购自廊坊恒益生物技术有限公司。

1.3方法

1.3.1资料收集 从医院电子病历中收集患者的一般资料，包括性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、手术时间、术中输血、术中使用呼吸机、合并基础疾病情况[糖尿病、高血压、冠心病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等]、术前美国麻醉医师协会(ASA)分级情况、术后第3天实验室相关指标[WBC、CRP、ESR、Hb、红细胞分布宽度(RDW)、ECR1-RR、红细胞补体受体1几何平均荧光强度(ECR1-GMFI)、清蛋白(ALB)]水平等。

1.3.2ECR1-RR检测方法 术后第3天抽取患者静脉血5 mL于肝素抗凝管中，2 000 r/min离心5 min，经生理盐水洗涤、离心3次(每次轻轻吹散管底部沉积的红细胞，2 000 r/min离心5 min，用吸管小心吸取上层生理盐水弃去)，显微镜下计数红细胞，然后配制成1.25×107/mL红细胞悬液备用。根据郭峰法[6]检测ECR1-RR，具体如下：将补体致敏酵母多糖冻干试剂溶解后制成使用液。红细胞悬液用生理盐水洗涤、离心1次，按红细胞计数法配成1×108/mL红细胞使用液备用。取试管加入红细胞使用液0.075 mL，再加入补体致敏酵母多糖使用液0.075 mL，放入37 ℃水浴箱，30 min后取出，加入0.25%戊二醛 50 μL轻轻混匀，涂片，晾干，甲醛固定，加入少许瑞氏液及瑞氏缓冲液(pH值为8.4)，生理盐水冲洗。显微镜下计数。

1.3.3ECR1-GMFI检测方法 术后第3天抽取患者静脉血1.5 mL于枸橼酸钠抗凝的真空采血管中，混匀。取流式细胞仪专用试管，加入上述抗凝血5 μL，再加入20 μL荧光抗体和100 μL PBS，混匀后室温避光放置20 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加PBS 1 000 μL重悬，1 500 r/min离心5 min，重复4次，弃上清，加PBS 300 μL，混匀后上机检测。用全自动FACS CantoTMⅡ流式细胞仪检测ECR1-GMFI，严格按照仪器说明书进行操作。

2 结 果

2.1两组患者临床资料比较 两组患者性别、年龄、ESR、WBC、ECR1-RR、ECR1-GMFI、ALB、CRP水平，吸烟、COPD、贫血、ASA分级≥Ⅲ级、术中使用呼吸机的患者所占比例，以及手术时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者BMI、RDW水平，高血压、糖尿病、冠心病、术中输血患者所占比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组患者临床资料比较

组别nWBC(x±s,×109/L)贫血[n(%)]RDW(x±s,%)ESR(x±s,mm/h)ECR1-RR(x±s,%)ECR1-GMFI(x±s)肺炎组4613.73±2.6325(54.35)13.12±4.5133.11±8.8218.45±2.1657.38±11.44对照组7247.11±2.33276(38.12)12.42±3.8125.22±4.3222.07±3.4772.92±11.17t/χ218.7014.7801.1307.844-12.690-9.137P<0.0010.0290.258<0.0010.034<0.001

组别nALB(x±s,g/L)CRP(x±s,mg/L)ASA分级≥Ⅲ级[n(%)]手术时间(x±s,min)术中使用呼吸机[n(%)]术中输血[n(%)]肺炎组4634.72±5.1158.01±11.8020(43.48)75.75±20.3114(30.43)41(89.13)对照组72436.51±5.2245.18±20.74182(25.14)65.22±15.38133(18.37)619(85.50)t/χ2-3.5787.3867.5185.6564.0760.466P0.001<0.0010.006<0.0010.0440.495

2.2WBC、ECR1-RR、ECR1-GMFI水平与患者术后肺炎发生的相关性 WBC水平与ECR1-RR、ECR1-GMFI水平呈负相关(r=-0.136、-0.270，P<0.05)，ECR1-RR水平与ECR1-GMFI水平呈正相关(r=0.709，P=0.002)。进一步分析上述3项指标与患者术后肺炎发生的相关性，结果显示，WBC水平与患者术后肺炎发生呈正相关(r=0.550，P<0.05)；ECR1-RR、ECR1-GMFI水平与患者术后肺炎发生呈负相关(r=-0.289、-0.313，P<0.05)。

2.3患者术后发生肺炎的危险因素分析 将结果2.1中差异有统计学意义的指标(ECR1-RR除外，因ECR1-RR、ECR1-GMFI均是反映ECR1数量的指标，在多因素Logistic回归分析中，为避免二者因共线而互相干扰，仅采用ECR1-GMFI进行分析，并对其进行标准化处理)纳入多因素Logistic回归分析模型，结果显示，年龄>80岁、吸烟、WBC>10×109/L、贫血、标准化的ECR1-GMFI水平降低、ASA分级≥Ⅲ级、手术时间≥60 min是患者术后发生肺炎的独立危险因素(P<0.05)，在调整了性别、年龄>80岁、吸烟、COPD、贫血、ESR水平升高、低清蛋白血症、CRP水平升高、ASA分级≥Ⅲ级、手术时间≥60 min、术中使用呼吸机等因素后，WBC>10×109/L、标准化的ECR1-GMFI水平降低仍然是患者术后发生肺炎的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 多因素Logistic回归分析结果

2.4ECR1-GMFI、WBC单独及联合检测对患者术后发生肺炎的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，ECR1-GMFI联合WBC诊断患者术后发生肺炎的曲线下面积(AUC)为0.984，灵敏度为96.32%，特异度为91.57%，高于2项指标单独检测。见表3。

表3 ECR1-GMFI、WBC单独及联合检测对患者术后发生肺炎的诊断价值

3 讨 论

每个红细胞上的补体受体1(CR1)为50～1 400个，明显少于B细胞和吞噬细胞上的CR1数量，但人体内红细胞数是白细胞数的1 500倍左右[7]，因此，体内90%的CR1存于红细胞膜上。红细胞主要通过ECR1参与抗原及循环免疫复合物的免疫黏附、抗原提呈、氧化杀菌，因此，ECR1作为跨红细胞膜的捕获抗原及循环免疫复合物的介质发挥着重要作用[8]。国内关于红细胞免疫指标的临床研究中，多采用郭峰法检测ECR1-RR，即人工统计形成花环的红细胞数，计算花环率，进而得出红细胞免疫水平[4-5,8-10]。喻德富[11]研究发现，髋部骨折患者的ECR1-RR水平显明显低于健康对照人群，进行人工全髋关节置换术后患者ECR1-RR水平进一步降低，这是因为在严重外伤与手术后，ECR1结合大量受伤部位释放的免疫复合物，并提呈给免疫组织吞噬或分解，从而导致待结合的ECR1减少，清除循环免疫复合物的能力下降[12]。

罗庆峰等[10]采用流式细胞仪检测ECR1数量，并发现其与红细胞天然免疫黏附肿瘤细胞功能呈显著正相关(r=0.609，P<0.05)，因此认为ECR1是红细胞天然免疫黏附肿瘤细胞发挥功能的物质基础。本研究相关性分析发现，ECR1-RR、ECR1-GMFI水平与患者术后肺炎发生呈负相关(r=-0.289、-0.313，P<0.05)，提示ECR1-RR、ECR1-GMFI作为反映红细胞膜上待结合ECR1数量的指标，其水平降低与股骨粗隆间骨折患者术后发生肺炎有关。WBC作为感染性疾病诊断的敏感指标之一，其水平升高提示存在感染的可能，本研究中WBC水平与ECR1-RR、ECR1-GMFI水平呈负相关(r=-0.136、-0.270，P<0.05)，提示ECR1-RR、ECR1-GMFI与感染的发生也有一定关系。李慧等[13]研究发现，剖宫产术后感染组ECR1-RR水平明显低于非感染组，且随着感染组WBC水平升高，ECR1-RR水平逐渐下降。一般认为在感染发生部位白细胞在趋化因子的诱导下聚集并吞噬、溶解病原体及病变细胞，同时在发生感染时细菌被补体C3b、iC3b、C4b标记然后被红细胞膜上的ECR1结合(即免疫黏附)，在血液中，这种免疫黏附使细菌、免疫复合物、经调理的细胞片段被红细胞运输到肝和脾的血窦，最终被血窦中的吞噬细胞吞噬、溶解[14]。BREKKE等[8]通过比较不同ECR1数量的全血标本清除细菌的能力发现，ECR1数量与血浆中游离细菌数量、粒细胞吞噬作用呈负相关。虽然在轻症感染患者中CRP、ESR水平升高往往比临床体征出现得更早，但在本研究中ESR、CRP水平升高都不是股骨粗隆间骨折患者术后发生肺炎的独立危险因素，考虑出现该结果的原因可能为：手术造成的软组织损伤、术区的坏死组织及局部淤血吸收，以及手术植入物的异物反应都会造成CRP、ESR水平升高，从而干扰了其对感染的监测能力，因此，上述2项指标不适合在大型手术后作为早期感染的监测指标。在调整了性别、年龄>80岁、吸烟、COPD、贫血、ESR水平升高、低清蛋白血症、CRP水平升高、ASA分级≥Ⅲ级、手术时间≥60 min、术中使用呼吸机等因素后，WBC>10×109/L、标准化的ECR1-GMFI水平降低仍然是股骨粗隆间骨折患者术后发生肺炎的独立危险因素(P<0.05)。进一步分析WBC与ECR1-GMFI对患者术后肺炎的诊断价值，结果显示，WBC与ECR1-GMFI联合检测的诊断效能高于各项指标单独检测，提示临床可将红细胞免疫指标ECR1-GMFI与WBC联合用于患者术后肺炎的早期诊断，以提高诊断效能。

综上所述，ECR1-GMFI水平下降是老年股骨粗隆间骨折患者术后发生肺炎的独立危险因素，且将其与WBC联合还可提高对患者术后肺炎的诊断效能。此外，本研究为回顾性研究，虽然在一定程度上控制了混杂因素对结果的干扰，但是所得结论仍然需要更严格的大样本随机对照研究进一步验证。