苹果Dof转录因子生物信息学及其表达分析

王新亮 彭玲 王健 贾晶晶 唐立平

摘要： 为了解苹果Dof转录因子家族的生物学信息与功能，利用苹果基因组GDDH13 v1.1检索及RNA-seq转录本重构找到51个Dof 基因，并通过 Pfam 和SMART检测确认，进一步对这些Dof基因进行全面分析。结果表明，除MD07G1265700外，其他50个Dof蛋白均含有一个明显的Dof结构域，且有一个CX2CX21CX2C基序。这些Dof基因编码氨基酸数为163～523，相对分子质量为18 210～55 800，等电点为5.01～10.30，多数Dof成员定位于细胞核中， 少数定位于叶绿体或线粒体中。组织特异表达显示多数Dof 基因在营养器官中的表达量高于生殖器官，而MD01G1084700、MD07G1153300、MD08G1040100、MD15G1034500基因在未成熟的果肉中表达量最高。盐碱胁迫下，除MD05G1023800基因没有检测到表达外，其他Dof基因的表达均受盐碱胁迫影响，只是响应强度和时间有差异，基因表达显著上调的有7个，显著下调的有15个。该研究结果为进一步揭示苹果Dof转录因子生物功能奠定了理论基础。

关键词： 苹果;Dof基因;转录因子;表达分析;生物信息学

中图分类号： S661.1  文献标识码： A  文章编号： 1000-4440（2021）02-0480-13

Abstract： In order to understand the biological information and function of apple Dof transcription factor family， 51 Dof genes were found by searching apple genome GDDH13 v1.1 and RNA-seq transcripts reconstruction， and they were confirmed as members of Dof transcription factor family by Pfam and SMART detection. The Dof genes were generally analyzed furtherly. The results showed that， besides MD07G1265700， the other 50 Dof proteins all contained an obvious Dof domain and a CX2CX21CX2C motif. The number of amino acids encoded by Dof gene ranged from 163 to 523， and the relative molecular weight ranged from 18 210 to 55 800， while the isoelectric point ranged from 5.01 to 10.30. Most of the Dof proteins were located in the nucleus， and a few of them were located in the chloroplast or mitochondria. The results of tissue-specific expression showed that the expression level of most of the Dof genes expressed in vegetative organs were higher than in reproductive organs， while the expression levels of MD01G1084700， MD07G1153300， MD08G1040100 and MD15G1034500 were the highest in immature fruit flesh. Under saline-alkali stress， except for MD05G1023800 gene， the expression of other Dof genes were affected by saline-alkali stress， but the intensity and time of response were different. There were seven Dof genes significantly up-regulated and 15 Dof genes significantly down regulated. The research results lay a theoretical foundation for further study on the biological function of Dof transcription factor in apple.

Key words： apple;Dof gene;transcription factor;expression analysis;bioinformatics

蘋果（Malus pumila Mill.）是蔷薇科中重要的果树之一，与其他果树相比，具有种植面积大、货架期长等特点，苹果在中国的种植面积和产量均为世界首位。土壤盐碱、干旱、倒春寒等非生物胁迫制约着苹果产业的发展[1]。

Dof （DNA binding with one finger）蛋白是一类植物特有的转录因子[2]，其N端含有一个由50～52个氨基酸组成的高度保守的锌指结构——Dof结构域，此结构域中含有1个高度保守的CX2CX21CX2C基序。Dof蛋白既能与特定的DNA序列结合调节基因表达，也能与某些蛋白质相互作用，参与植物生长发育及非生物胁迫响应的调控[3-5]。Dof蛋白识别的核心序列是5′-AAAG-3′或5′-CTTT-3′[6];其C端氨基酸序列变异性较大，是Dof蛋白的转录调控结构域[7]。在单子叶植物和双子叶植物均发现了许多Dof蛋白。目前，在小麦、大豆、水稻和拟南芥的基因组中，分别有31、78、30 和 36个Dof基因被发现[8-10]。植物中存在如此多的Dof基因说明其参与植物多种复杂的生理功能控制。

本研究利用苹果基因组，通过Dof结构域序列检索和RNA-seq转录本重构，筛选并鉴定出51 个苹果Dof基因家族成员，全面分析了它们编码的Dof转录因子的Dof结构域、保守基序、亚细胞定位、系统进化树及其特异性表达。以期为进一步研究Dof基因在调控苹果生长发育及非生物胁迫响应等过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理

平邑甜茶种子用0.2% KMnO4浸泡30 min，然后用流水冲洗干净，与洗净的细沙混匀置于4 ℃层积60 d。种子露白后播种在装有种植土（细砂、蛭石、土的体积比为3∶2∶1 ）的育苗盘中，并置于滨州学院黄河三角洲生态环境重点实验室苗圃中露天管理，每隔5 d浇1次 1/2 Hoagland营养液（pH=6.8±0.2）。当平邑甜茶苗长到6片真叶时，用加入了100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Na2SO4及50 mmol/L NaHCO3的1/2 Hoagland营养液（pH=8）处理，在第0 d、1 d、3 d、6 d分别采集叶片和新根（每个样品3次重复）存放在液氮中备用。

1.2 RNA 提取和转录组测序

样品总RNA用TRIzol试剂盒提取，利用磁珠富集mRNA，然后利用打断Buffer将获得的RNA片段化，使用随机N6引物进行反转录合成，再合成cDNA第二条链。通过特异引物进行PCR扩增。热变性使PCR产物形成单链，再利用桥式引物将单链DNA环化最终得到单链环状DNA文库。使用BGISEQ-500平台测序，所得原始数据经纯化去除低质量、接头及未知碱基N含量过高的read后得到可靠的高质量序列，使用HISAT将所得序列比对到参考基因组序列（Malus x domestica GDDH13 Whole Genome v1.1，https：//www.rosaceae.org/species/malus/malus_x_domestica/genome_GDDH13_v1.1）[11]。

1.3 GDDH13Dof轉录因子筛选与鉴定

利用Dof结构域序列，在苹果基因组GDDH13 v1.1 mRNA进行BLAST序列比对并搜索“Dof”关键词筛选苹果Dof候选基因。利用StringTie （http：//ccb.jhu.edu/software/stringtie） 对平邑甜茶转录组测序结果进行转录本重构，然后用Cuffmerge （http：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks） 将所有样品的重构信息整合在一起，再使用Cuffcompare （http：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks） 将整合后的转录本与参考注释信息比较，挑选出新转录本，然后使用CPC2 （http：//cpc2.cbi.pku.edu.cn/）[12]预测新转录本编码蛋白质的潜力，然后将具有蛋白质编码潜力的新转录本加入参考基因中，最后通过Pfam （http：//pfam.xfam.org）[13] 和SMART （http：//www.smart.embl-heidelberg.de/）对鉴定出的Dof蛋白进行确认。通过ExPASy网站 （https：//web.expasy.org/protparam/）对苹果Dof蛋白的理化性质进行分析[14]。

1.4 Dof蛋白系统进化树、保守域和保守基序分析

从拟南芥信息数据库（TAIR https：//www.arabidopsis.org/ ）下载获得拟南芥的Dof转录因子的氨基酸序列。利用MAFFT version 7 （https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）比对 Dof结构域[15]。通过MAFFT online service和Evolview v3 （https：//www.evolgenius.info//evolview/#mytrees//）进行系统进化树构建[15-16]，用Average linkage （UPGMA）法构建进化树，参数均为默认值。利用GSDS2 （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制基因结构图[17]。利用MEME 5.1.1版本 （http：//memesuite.org/tools/meme）分析Dof蛋白保守基序（数目设为15，宽度为6～50 aa）[18]。Dof蛋白亚细胞定位用在线软件WoLF PSORT （https：//wolfpsort.hgc.jp/） 预测。

1.5 Dof表达分析与功能注释

从AppleMDO （http：//bioinformatics.cau.edu.cn/AppleMDO/）网站的RNA-seq数据下载Dof 基因在7个不同组织（茎尖、叶片、茎、花、未成熟果肉、成熟果肉、成熟果皮）中的表达数据[19]，利用Excel绘制表达热图。利用AppleMDO数据库的GO analysis功能以GDDH13 v1.1 homology with Arabidopsis为参考进行GO分析。

2 结果与分析

2.1 Dof基因的筛选与鉴定

利用Dof结构域序列，在GDR数据库苹果基因组（Malus x domestica GDDH13 Whole Genome v1.1）[11]进行BLAST序列比对，筛选Dof 候选基因。并对平邑甜茶转录组测序结果进行转录本重构，挑选出新转录本，然后使用CPC2预测新转录本的蛋白质编码潜力，将新转录本中具有蛋白质编码潜力的添加到参考基因中。然后通过Pfam和SMART在线工具对筛选出的Dof蛋白进行确认，共筛选鉴定出51个Dof家族成员。但是通过MAFFT version 7对这些Dof转录因子的Dof结构域进行比对，发现只有50个基因具有典型的Dof结构域（图1），由图1可以看出，有50个Dof转录因子均含有1个明显的高度保守的Dof结构域，且结构域内均含有CX2CX21CX2C基序构成的单锌指结构。而MD07G1265700虽然通过Pfam和SMART在线工具被鉴定为Dof家族成员，但是通过序列对比发现其并不存在典型的CX2CX21CX2C单锌指结构。对Dof基因的定位，编码蛋白质的相对分子质量、等电点等理化性质进行分析（表1）。这些 Dof 基因在苹果各个染色体上均有分布，它们编码的蛋白质的长度为163～523 aa;相对分子质量为18 210～55 800;等电点为5.01～10.30。亚细胞定位预测结果表明，除MD05G1023800、MD07G1265700、MD10G1280000可能定位于叶绿体中，MD05G1301100 可能定位于叶绿体或/和细胞核中，MD15G1275300可能定位于线粒体中，其他Dof蛋白均主要定位于细胞核中。

2.2 Dof家族蛋白系统进化树

利用鉴定的Dof蛋白与拟南芥的Dof蛋白氨基酸序列构建了一个系统进化树（图2）。 Dof蛋白分成11组。在这51个Dof蛋白中，8个分到A组，8个分到B组，2个分到C组，2个分到D组，6个分到E组，5个分到F组，4个分到G组，2个分到H组，9个分到I组，2个分到J组，3个分到K组。

2.3 Dof基因结构分析

利用GDDH13 v1.1基因组注释文件gene_models_20170612.gff3.gz绘制了Dof基因结构图（图3）。图3显示，进化树分析中亲缘关系近的基因，它们的基因结构也相似。但是成员较多的A、B和I组中，基因结构差异较大。

2.4 Dof蛋白保守motif分析

利用MEME在线软件对Dof蛋白氨基酸序列进行motif分析，可以看到Dof蛋白含有15个高度保守的motif，虽然它们的数目和位置差异较大，但是根据进化树分析，亲缘关系近的Dof蛋白的motif数量和序列相似度较高（图4）。其中50个Dof蛋白均含有1个保守的CX2CX21CX2C基序（含有motif 1或motif 13），而MD07G1265700 既不含有motif 1，也不含有motif 13。

2.5 Dof基因组织特异性表达

利用AppleMDO数据库的RNA-seq数据，分析了Dof基因在茎尖、叶片、茎、花、未成熟果肉、成熟果肉和成熟果皮中的表达（图5）。除MD12G1041000基因和MD14G1040400基因没在任何组织中检测到表达外，其他Dof 基因均至少在一个组织中检测到表达;这些Dof基因在茎、叶片、茎尖等营养器官（组织）中的表达量大多高于在花、果肉、果皮等生殖器官（组织）中的表达量。而MD01G1084700、MD07G1153300、MD08G1040100、MD15G1034500基因在未成熟的果肉中表达量最高，在成熟果肉中均未被检测到。

2.6 平邑甜茶Dof基因在盐碱胁迫下的表达分析

近年来，越来越多的研究结果表明Dof基因参与植物对干旱、盐碱等非生物胁迫响应的调控。本研究利用RNA-seq技术检测了平邑甜茶在盐碱胁迫0 d、1 d、3 d、6 d后叶片和根中Dof基因的表达情况（图6）。在平邑甜茶中，除MD05G1023800基因没有检测到表达外，其他Dof基因均检测到1次及以上的表达，而且大多数Dof基因在根中的表达量显著高于叶片。与对照（0 d）相比，在盐碱胁迫下平邑甜茶根系中表达显著上调的Dof基因有MD13G1070600、MD00G1125100、novelG001312、MD16G1071400、MD05G1318600、MD10G1297900、MD05G1018200基因。与对照（0 d）相比，表达显著下调的基因有MD15G1309400、MD02G1161200、MD14G1040400、MD01G1041500、MD14G1216800、MD07G1265700、MD15G1034500、MD15G1275300、MD06G1194100、MD06G1173600、MD06G1205900、MD05G1312400、MD14G1180100、MD07G1057700、MD05G1301100基因。

2.7 功能注释

利用AppleMDO数据库的GO analysis功能对已有的50个Dof基因进行了GO功能分析，结果显示，共涉及到40个GO条目 （图7），其中细胞组成 （CC） 9个、分子功能（MF） 3个、生物过程（BP） 28个。除分子功能中蛋白质结合和生物过程中细胞组分组织、对非生物胁迫反应、对刺激反应等9个条目参与的基因较少，其余GO条目均有50个Dof基因参与。

3 结论与讨论

Dof转录因子在植物调节生长发育与响应非生物胁迫中起着重要作用[20-22]。目前，Dof基因的报道主要集中在草本植物中[8-10]，在木本植物中报道较少。本研究对GDDH13 v1.1基因组预测基因进行了较全面的检索，从已有基因中共检索并鉴定了50个Dof转录因子基因。另外通过对平邑甜茶转录组测序结果进行转录本重构，挑选出新转录本，然后使用CPC2对新转录本进行蛋白质编码潜力预测，然后通过Pfam和SMART在线工具鉴定出1个新的Dof基因，并命名为novelG001312。其中MD07G1265700虽然通过Pfam和SMART在线工具被鉴定为Dof转录因子家族成员，但是通过氨基酸序列比较和motif 分析发现其并不存在典型的CX2CX21CX2C单锌指结构，说明MD07G1265700可能不属于Dof转录因子家族。

有研究结果表明：不同植物Dof蛋白的理论等电点基本处于5.41～6.97，且一般碱性氨基酸个数多于酸性氨基酸[23]。但本研究中苹果Dof蛋白的等电点主要集中在5.01～10.30，多为碱性氨基酸，与小桐子和大豆Dof蛋白的等电点研究结果相似[24-25]，说明不同植物间Dof家族成员的等电点差异较大[26]。

系统进化树能为预测同源基因的功能提供一些依据。DAG1 （AtDof3.7） 能通过抑制GA3ox1基因，减少赤霉素含量，从而抑制种子萌发;而DAG2（AtDof2.5）能促进种子萌发[27-28]，MD01G1084700、MD01G1224500、MD06G1114000、MD07G1153300、MD07G1295200、MD14G1135300与DAG1、DAG2位于A组的一个分支上，说明它们也可能参与种子的萌发调控。拟南芥CDF1、CDF2和CDF3通过抑制CONSTANS基因转录来控制开花期[29-30]，I组中MD00G1125100、MD06G1194500、MD13G1070600、MD14G1201600、MD16G1071400、novelG001312与上述3个转录因子较近，它们也可能参与苹果花期调控。B组中，MD09G1195800、MD17G1176100和ADOF1在一個分支，ADOF1在胼胝质组织中表达量较高，ADOF1可能影响酚类化合物的合成[31]。因此，MD09G1195800和MD17G1176100也可能与该功能有关。在氧化胁迫和水杨酸诱导下，OBP1能调节防御基因表达，OBP1还与细胞分裂周期有关[32]，与其在同一分支上的MD02G1161200、MD08G1040100、MD15G1034500、MD15G1275300也可能具有类似的功能。

进化树分析中，位于同一分支的基因亲缘关系近，而亲缘关系越近[33-36]，Dof基因的结构及其编码的氨基酸序列的motif数量和相似度越高。转录因子家族含有的motif 在相同的组中是高度保守的[37]。通过motif 分析，51个Dof蛋白含有15个高度保守的 motif，其中motif 1和motif 13含有CX2CX21CX2C单锌指结构。除MD07G1265700不含有motif 1和motif 13，MD14G1201300、MD06G1194100、MD05G1023800各含有1个motif 13，其他Dof蛋白各含有1个motif 1。表明在相同组中含有相同保守基序的Dof蛋白也许具有相似的功能。

基因表达模式能为其功能预测提供一定的参考[37-38]。OBP2在拟南芥的根和叶片中表达量最高，在茎和花中表达量低于根和叶[39]，OBP2可以调控拟南芥硫代葡萄糖苷的生物合成[40]。同在E组的MD04G1126500、MD12G1078400、MD03G1096400、MD07G1197500、MD11G1111100、MD01G1126700基因也是多数在根、叶中表达量较高。GO分析结果表明，它们都参与生物合成和代谢的调控，因此推断这些基因可能参与苹果次生代谢的调控。OBP4在拟南芥各个组织器官中均有表达，并参与细胞周期和细胞扩增的负调控[22]。同在F组的MD00G1115200、MD10G1292200、MD07G1265700、MD06G1205900、MD14G1216800基因也在各个组织均表达，且多数在花中的表达量最高。说明它们可能主要参与花中细胞周期的调控。MD01G1084700、MD07G1197500、MD08G1040100和MD15G1034500基因在未成熟的果肉中表达量最高，在成熟果肉中均未被检测到，它们可能与果实的生长发育有关。

本研究中，除MD05G1023800基因没有检测到表达外，其他Dof基因的表达均对盐碱处理有响应，只是响应强度和时间有差异。在盐碱胁迫下，显著上调的Dof基因有7个，显著下调的有15个。总之，苹果大部分Dof 家族基因可能在盐碱胁迫响应中起重要的调控作用，但它们的功能还需要进一步验证。

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（责任编辑：陈海霞）