樱桃谷鸭种公鸭睾丸发育和生殖轴基因表达

陈蓉 雷明明 何宗亮 朱欢喜 戴子淳 应诗家

摘要： 为了揭示樱桃谷鸭种公鸭的睾丸发育规律，本研究以75日龄、105日龄、135日龄和165日龄樱桃谷鸭种公鸭为研究对象，首先通过组织学方法观察睾丸发育和精子发生情况，其次通过Q-PCR方法检测下丘脑-脑垂体-睾丸轴组织中相关基因表达情况。结果发现，与105日龄相比，135日龄时睾丸质量增加了10倍以上，曲精细管直径和上皮生精细胞数量增加，脑垂体FSHβ基因mRNA表达量增加了40倍以上。与75日龄相比，105～165日龄脑垂体组织中GnIHR基因mRNA表达量显著降低。随着日龄增加，樱桃谷鸭种公鸭睾丸支持细胞特异性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因和间质细胞特异性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表达量显著增加。以上结果表明，自135日龄开始，在脑垂体FSH和LH刺激下，樱桃谷鸭种公鸭睾丸进入快速发育阶段，支持细胞和间质细胞的分泌功能增强;165日龄时，睾丸能够产生成熟精子，表明睾丸发育达到性成熟阶段。本研究结果为后续樱桃谷鸭种鸭的繁殖研究提供基础资料。

关键词： 樱桃谷鸭;睾丸;生殖轴;基因表达

中图分类号： S834  文献标识码： A  文章编号： 1000-4440（2021）02-0405-07

Abstract： In order to understand the testicular development of Cherry Valley breeder ducks， this study took 75， 105， 135， and 165 day-old Cherry Valley breeder ducks as the research objects. Firstly， the testicular development and spermatogenesis were defined through histological methods， and secondly the mRNA expression levels of reproductive axis genes were detected by the method of Q-PCR. The results showed that compared with the 105th day， the testicular weight of Cherry Valley breeder ducks on the 135th day increased by more than 10 times with the increase of the diameter of seminiferous tubules and the number of epithelial spermatogenic cells， and the mRNA expression level of their pituitary FSHβ gene increased by more than 40 times. Compared with the 75th day， the mRNA expression level of pituitary GnIHR gene was significantly reduced on the 105th， 135th， and 165th day respectively. With the increase of days， both the mRNA expression levels of sertoli cell-specific FSHR， INHα， INHβA， AMH genes and Leydig cell-specific LHR， StAR， CYP11A1， 3β-HSD genes were significantly increased in the testicular tissues of Cherry Valley breeder ducks. The above results suggested that the testicular tissues of Cherry Valley breeder ducks had underwent the rapid development since the 135th day under the stimulation of FSH and LH of the pituitary gland， and the secretory function of both Sertoli cells and Leydig cells was enhanced; on the 165th day， the testes could produce mature sperms， indicating that the testicular development had reached sexual maturity. This study provides the basic data for the subsequent research on the reproductive activity of Cherry valley breeder ducks.

Key words： Cherry valley drake;testis;reproductive axis;gene expression

中國是世界肉鸭养殖和消费大国，2019年肉鸭出栏质量约占全球68%[1]。2019年，中国肉鸭总出栏量约4.43×109只，总产肉量约9.44×106 t，鸭肉总产值达到1.42×1011元。在中国，大量饲养的肉用型鸭品种包括北京鸭、樱桃谷鸭、丽佳鸭、狄高鸭等。樱桃谷鸭是以北京鸭为育种材料选育而成的，具有生长速度快、瘦肉率高和饲料转化率高以及抗病性强等优点。但是，与中国地方蛋用型鸭（如连城白鸭）相比，樱桃谷鸭（肉用型）种鸭体型大，性成熟时间晚。目前，有关樱桃谷种鸭的研究主要集中在养殖模式升级和产蛋性能提高方面[2-3]，对于其性成熟启动和睾丸发育的研究很少。

禽类性腺发育过程受到下丘脑-脑垂体-性腺轴的内分泌调控[4]。在性成熟前某一时间点，下丘脑促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone， GnRH）脉冲释放增加，引起脑垂体卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone， FSH）和黄体生成素（Luteinizing hormone， LH）的分泌增加，进而刺激性腺发育[5-6]。此外，FSH和LH分泌受到下丘脑促性腺激素抑制激素（Gonadotropin-inhibitory hormone， GnIH）的调控[7]。在睾丸组织中，FSH通过特异性受体（FSH receptor， FSHR）作用于支持细胞，促进支持细胞增殖和分化;LH则通过特异性受体（LH receptor， LHR）作用于间质细胞，促进睾酮合成和分泌。睾酮是维持精子产生过程所必需的，主要通过旁分泌方式作用于支持细胞间接调控精子产生[8]。支持细胞能够分泌多种生长因子，如抑制素A（INHα和INHβA亚基形成的异二聚体）负反馈调控脑垂体FSH分泌[9]，抗缪勒氏管激素（Anti-mullerian hormone， AMH）抑制间质细胞分泌睾酮[10]。为了揭示樱桃谷鸭种公鸭的睾丸发育规律，本研究拟以不同日龄的樱桃谷鸭种公鸭为研究对象，首先通过组织学方法观察睾丸发育和精子产生情况，其次通过实时定量PCR（Real-time quantitative PCR， Q-PCR）方法检测下丘脑-垂体-睾丸轴组织中基因表达情况。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取樱桃谷鸭种鸭（父母代）雏鸭140只（公鸭母鸭各70只），饲养于南京市畜牧家禽科学研究所养殖基地。地面育雏结束后，采用半舍内饲养方式进行混群饲养，舍内设有独立的饲槽，舍外设有水上运动场。人工定时定量喂料，卫生防疫工作按照种鸭饲养管理基本要求进行，日粮营养标准按照种鸭标准进行配制。

1.2 样本采集与激素测定

分别随机选取75日龄、105日龄、135日龄和165日龄公鸭各8只，宰前禁食12 h，称取活体质量后，翅靜脉采血，静置30 min后分离血清，-20 ℃保存。经颈部放血致死后，采集左右两侧睾丸组织并称质量。其中，左侧睾丸组织一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蜡切片制作;一部分置于液氮中快速冷冻，用于总RNA提取。同时，采集每个个体的下丘脑和脑垂体组织，置于液氮中快速冷冻，-80 ℃保存。

采用北京北方生物技术研究所有限公司睾酮检测试剂盒（酶联免疫法）进行血清睾酮质量浓度测定。

1.3 石蜡切片制作和组织学观察

睾丸组织经4%多聚甲醛溶液固定24 h后，各日龄公鸭随机挑选3个样本，每个样本切取一小块组织（0.125 cm3），首先置于乙醇梯度溶液（体积分数为60%、70%、90%和95%乙醇）中进行逐级脱水，然后置于二甲苯溶液中进行透明处理2次，最后置于石蜡中进行透蜡处理，并制备成石蜡块。石蜡切片（5 μm）固定于载玻片上，进行苏木精-伊红染色。染色切片置于光学显微镜下拍照并观察曲精细管直径以及精原细胞、精母细胞和精细胞数量。

1.4 基因表达分析

采用动物组织总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司产品]提取总RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度（OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.0）和含量。采用PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司产品]以总RNA为模板合成互补cDNA第一链。

根据GenBank中绿头鸭或者近缘物种相关mRNA序列设计基因特异性引物（表1），以β-肌动蛋白（β-actin）为内参基因，按照TransStart Top GreenSuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司产品）的说明书配制反应体系并在ABI 7500 Real-Time PCR仪上进行Q-PCR反应，每个样品重复3次。其中，GnRH-I、GnRHR、GnIH、GnIHR、LHβ、FSHR、INHα、INHβA、LHR基因引物序列引自参考文献[11]～[14]。

1.5 数据分析

采用2-△△Ct法进行Q-PCR试验数据处理，目的基因的mRNA表达量采用平均数±标准差的形式表示。采用SPSS软件进行统计分析，均值比较采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD法。为了缩小不同日龄数据间存在的差异，对睾丸质量、FSHβ、LHβ、FSHR、AMH、INHα、INHβA、LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因mRNA表达量等数据在统计分析前进行对数转化处理。

2 结果与分析

2.1 不同日龄樱桃谷鸭种公鸭睾丸发育和血清睾酮浓度变化

随着日龄增加，樱桃谷鸭种公鸭的体质量逐渐降低并达到开产前标准体质量（图1A），其睾丸质量和睾丸指数急剧增加（图1B、图1C）。与105日龄相比，135日龄时睾丸质量增加了10倍以上，表明此时睾丸进入快速发育阶段。组织学观察结果表明，随着日龄增加，睾丸曲精细管直径和上皮生精细胞数量增加（图2）。75～105日龄时，睾丸曲精细管上皮由单层变为双层，主要由支持细胞和精原细胞组成;135日龄时，睾丸曲精细管上皮变为多层，出现了不同发育阶段的生精细胞;165日龄时，睾丸曲精细管管腔中出现了成熟精子，表明睾丸发育达到性成熟阶段。随着睾丸发育至成熟，血清睾酮质量浓度显著增加（图1D）。

2.2 不同日龄樱桃谷鸭种公鸭下丘脑和脑垂体组织基因表达变化

随着日龄增加，樱桃谷鸭种公鸭下丘脑组织中GnRH-I和GnIH基因mRNA表达量呈现先降低后升高的趋势，但是不同日龄之间差异不显著（图3A、图3B）。与135日龄相比，165日龄时脑垂体组织中GnRHR基因mRNA表达量显著降低（图3C）。与75日龄相比，105～165日龄时脑垂体组织中GnIHR基因mRNA表达量显著降低（图3D）。与105日龄相比，135日龄时脑垂体组织中FSHβ基因mRNA表达量增加了40倍以上（图3E），表明此时睾丸进入快速发育阶段。LHβ基因与FSHβ基因的mRNA表达量变化趋势相一致（图3F）。

2.3 不同日齡樱桃谷鸭种公鸭睾丸组织基因表达变化

随着日龄增加，樱桃谷鸭种公鸭睾丸支持细胞特异性FSHR、INHα、INHβA、AMH基因的mRNA表达量显著增加（图4）。同时，睾丸间质细胞特异性LHR、StAR、CYP11A1、3β-HSD基因的mRNA表达量也显著增加（图5）。

3 讨论

本研究通过组织学和Q-PCR方法分别检测了不同日龄樱桃谷鸭种公鸭睾丸发育和生殖轴相关基因表达情况。结果表明，自135日龄开始，在脑垂体FSH和LH刺激下，樱桃谷鸭种公鸭睾丸进入快速发育阶段，支持细胞和间质细胞的分泌功能增强。165日龄时，睾丸能够产生成熟精子，表明睾丸发育达到性成熟阶段。

禽类性腺发育过程受到下丘脑-脑垂体-性腺轴的内分泌调控。当个体生长发育至某一时间点，下丘脑GnRH脉冲分泌增加，引起脑垂体FSH和LH分泌增加，进而刺激性腺发育。在本研究中，随着日龄增加，樱桃谷鸭种公鸭下丘脑GnRH-I和GnIH基因mRNA表达量无显著变化，但是脑垂体GnIHR基因mRNA表达量显著降低，表明GnIH活性降低与睾丸发育的启动有关。潘建秋[15]研究报道，对育成期公鸡主动免疫GnIH后，免疫组GnIH活性降低，脑垂体LHβ基因mRNA表达量增加，促进睾丸发育。与105日龄相比，135日龄时脑垂体FSHβ和LHβ基因mRNA表达量显著增加，推测这是由于GnIH活性降低所导致的。

135日龄开始，在高浓度FSH的刺激下，睾丸支持细胞和精原细胞快速增殖并发生分化，导致曲精细管直径增加，最终表现为睾丸质量增加。同时，在高浓度LH的刺激下，睾丸间质细胞合成睾酮能力增强，具体表现为LHR、StAR、CYP11A1和3β-HSD等睾酮合成相关基因mRNA表达量显著增加[16]。165日龄时，睾丸曲精细管中可见成熟精子，表明睾丸发育达到性成熟阶段。此时，脑垂体FSHβ基因mRNA表达量显著降低，这可能是睾丸支持细胞分泌的高浓度抑制素A负调控脑垂体FSH分泌的结果。在哺乳动物中，研究人员发现AMH能够直接作用于脑垂体调控FSH和LH分泌[17-18]，但在禽类中尚未有相关报道。在本研究中，165日龄樱桃谷鸭种公鸭睾丸AMH基因高表达是否与脑垂体FSHβ、LHβ基因mRNA表达量下调有关，需要进一步深入研究。

与中国地方蛋用型鸭相比，樱桃谷鸭（肉用型）种鸭体型大，性成熟时间晚[19]。姚远等[20]研究报道，连城白鸭90日龄时睾丸曲精细管中可见成熟精子。在本研究中，樱桃谷鸭种公鸭135日龄时睾丸曲精细管中尚未见成熟精子，比连城白鸭迟45 d以上。基于朱云芬等[21]的研究结果，血清LH浓度的显著增加与性腺组织的快速发育相一致，本研究推测樱桃谷鸭种公鸭脑垂体FSH和LH分泌量增加的时间晚于连城白鸭，因此性成熟时间被延迟。

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（責任编辑：陈海霞）