16S rRNA高通量测序研究柴芪汤对代谢综合征大鼠肠道菌群的影响

彭龙 张立平

摘要 目的：采用16S rRNA高通量测序技术分析柴芪汤对代谢综合征（MS）大鼠肠道菌群的影响。方法：通过Illumina Miseq PE300型高通量测序仪对大鼠粪便肠道菌群进行16S rRNA基因V3-V4可变區检测，运用Usearch、Mothur、LEfSe分析肠道菌群的组成结构及不同菌属相对丰度变化。结果：柴芪汤能够逆转MS大鼠肠道菌群物种多样性的下降，并纠正MS导致的菌群组成结构改变。研究发现MS大鼠的肠道菌群在菌属水平有57个菌属相对丰度发生显著变化，而柴芪汤能将其中的54个菌属恢复至正常水平。结论：从肠道微生态角度阐释了MS的可能病机，柴芪汤可以通过调节肠道菌群防治MS。

关键词 代谢综合征;柴芪汤;健脾疏肝;肠道菌群;16S rRNA高通量测序;炎症反应;短链脂肪酸;脂多糖

Effects of Chaiqi Decoction on Gut Microbiota in MS Rats Based on 16S rRNA

High-Throughput Gene Sequencing Study

PENG Long，ZHANG Liping

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Chaiqi Decoction on gut microbiota in metabolic syndrome rats based on high-throughput 16S rRNA gene sequencing.Methods：Illumina Miseq PE300 high-throughput sequencer was used to detect the 16S rRNA gene V3-V4 variable region of rat fecal intestinal flora.Usearch，Mothur，and LEfSe were used to analyze the composition and structure of intestinal flora and the relative abundance of different bacteria.Results：Chaiqi Decoction can reverse the decline in the species diversity of the intestinal flora of rats with metabolic syndrome and correct the changes in the composition and structure of the flora caused by the metabolic syndrome.The study found that the relative abundance of 57 genera of the intestinal flora of rats with metabolic syndrome changed significantly at the level of genus，and Chaiqi Decoction could restore 54 of them to normal levels.Conclusion：The possible pathogenesis of metabolic syndrome from the perspective of intestinal microecology is explained.Chaiqi Decoction could prevent and treat metabolic syndrome by regulating the intestinal flora.

Keywords Metabolic syndrome; Chaiqi Decoction; Invigorating spleen and soothing liver; Gut microbiota; 16S rRNA high-throughput gene sequencing; Inflammation reaction; Short-chain fatty acids; Lipopolysaccharide

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.014

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS）是一组复杂的代谢紊乱症候群，包括糖代谢异常、腹型肥胖、血脂代谢异常和高血压，是心脑血管疾病、慢性肾病、非酒精性脂肪肝等疾病的重要危险因素之一[1]。近年来研究发现，肠道菌群是影响人体物质能量代谢的重要因素，同时也是导致炎症介质过度表达、胰岛素抵抗，并进一步引起MS重要原因[2]，而中医学认为脾胃主运化，与肠道菌群功能相符，因此从调理脾胃即调节肠道菌群入手改善MS患者的代谢状态成为近年来的研究热点。张立平教授认为，肝失疏泄、脾失健运状态导致物质代谢能力下降是其发病的核心病机[3]，并提出应用健脾疏肝调理脾胃法治疗MS，拟方“柴芪汤”。前期研究中课题组已经证实柴芪汤能够纠正代谢异常状态，改善MS大鼠的胰岛素抵抗，减轻血管内皮损伤[4-10]。本研究采用微生物16S rRNA高通量测序技术，进一步研究MS及柴芪汤干预后大鼠肠道菌群结构与组成的变化，并鉴定丰度显著差异的菌属，从肠道微生态角度阐释柴芪汤防治MS的机制，并为柴芪汤在防治MS临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠;体质量（200±10）g;周龄：6～8周龄;来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物均饲养于北京中医药大学东方医院SPF级动物实验室[SYXK（京）2019-0013]中，室内温度：23～25 ℃，相对湿度（55±10）%，40 W日光灯照射，维持12 h光照和12 h黑暗的昼夜。自由进食、饮水。实验中对实验动物的处理遵循3R原则，并通过北京中医药大学东方医院伦理委员会审议（伦理审批号：201902）。

1.1.2 药物 柴芪汤颗粒（柴胡10 g、黄芪30 g、白术10 g、枳实10 g、三七粉3 g）由北京中医药大学东方医院制剂中心制备。

1.1.3 试剂与仪器 1）试剂：E.Z.N.A. soil DNA kit（美国Omega Bio-tek公司，货号：D5625-01）;琼脂糖（西班牙biowest公司，货号：BY-R0100）;NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（美国Bioo Scientific公司，货号：5144-08）;FastPfu Polymerase，（TransGen公司，货号：AP221-02）;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美国Axygen Biosciences公司，货号：AP-GX-50）;MiSeq Reagent Kit v3（美国Illumina公司，货号：MS-102-3003）。2）仪器：超微量分光光度计（Thermo Scientific公司，美国，型号：NanoDrop2000型）;PCR仪（ABI公司，美国，型号：9700型）;高通量测序仪（Illumina公司，美国，型号：Miseq PE300型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

按照本课题组前期研究已建立的造模方法[4]，用高糖高脂高盐饲料（基础饲料50%、熟猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇2%、奶粉7.5%、果糖10%、棕榈油5%、食用盐3%、鱼粉2%、胆盐0.5%，购自北京科澳协力饲料有限公司）。喂养SD大鼠8周，以制备代谢综合征动物模型，将造模成功后的大鼠应用随机数字表法随机分为模型组（7只）、观察组（7只）;普通饲料喂养的SD大鼠作为正常组（7只）。

1.2.2 给药方法 造模第9周，觀察组开始灌胃予柴芪汤药液11.34 g/（kg·d），并恢复普通饲料，连续给药4周;模型组继续高脂高糖高盐饲料喂养，并与正常组同时给予等量蒸馏水灌胃。

1.2.3 检测指标与方法 末次给药24 h后收集粪便，采用微生物16S rRNA高通量测序技术对粪便菌群进行分析。

1.2.3.1 肠道菌群DNA提取 采用E.Z.N.A. soil DNA kit试剂盒参照说明书对粪便样本进行微生物群落总DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。

1.2.3.2 16S rRNA基因PCR扩增及测序 1）预变性（95 ℃，3 min）。2）27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）。3）稳定延伸（72 ℃，10 min）。4）保存（4 ℃，ABI GeneAmp 9700型PCR仪）。PCR体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上游引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）0.8 μL，下游引物和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL，每个样本重复3次。

1.2.3.3 测序数据收集 1）回收（混合后，2%琼脂糖凝胶回收）。2）纯化（Purification）。3）检测（2%琼脂糖凝胶，Quantus Fluorometer定量检测）。4）建库（NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Ki）：a.接头链接;b.磁珠筛选去除接头自连片段;c.应用PCR扩增进行文库模板的富集;d.磁珠回收PCR产物得到最终的文库。5）测序（Illumina Miseq PE300平台，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序操作，原始数据上传至NCBI SRA数据库）。

1.2.3.4 测序数据分析 1）过滤：（窗口：50 bp;过滤：reads质量<20，长度<50 bp，包含N碱基）。2）拼接：（软件：FLASH;逻辑：PE reads之间的overlap关系;最小overlap长度为10 bp）。3）拼接筛选：（最大错配比率：20%）。4）修正（barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2）。5）分析（软件：UPARSE 7.1;相似度：97%;分析：OTU聚类分析;物种分类注释：RDP classifier;比对：Silva数据库（SSU128），比对阈值70%）。所有测序数据分析Trimmomatic质控下进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示;多组间比较，方差齐性者采用单因素方差分析，方差不齐者的采用非参数检验，设置95%为置信区间。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

模型验证及柴芪汤对MS大鼠代谢相关指标影响：本研究采用了与本课题组前期研究的造模方法，第16周检测并记录各组体质量、血糖、血清总胆固醇（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、收缩压/舒张压，模型组上述指标均显著高于正常组（P<0.05），同时符合《中国2型糖尿病防治指南2017版》及国际糖尿病联盟[2]的MS诊断标准，造模成功。同时柴芪汤能够显著降低模型大鼠的上述体征及指标，与前期研究一致[4，10]。

2.1 测序结果质量分析

1）14个样本通过测序经质控过滤后共获得816 954条有效序列数目，平均单个样本产生58 354条有效序列，平均序列长度418.549;341 771 653 bp有效碱基，平均单个样本24 412 261 bp有效碱基。在97%的相似度水平下对序列进行聚类，共发现735种OTUs。稀释曲线结果显示，曲线随测序量增加而趋向平缓，各样本物种丰度指数Sobs指数或多样性指数Shannon指数并不会随测序数据量的增加而继续增加。见图1。表明本研究所有样本序列充分，目前的测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种，获得数据可以用于分析。2）肠道菌群Alpha多样性分析：Alpha多样性分析后可得到丰度指数Sobs、Ace、Chao，多样性指数Shannon、Simpson，覆盖度指数Coverage。见表1。结果显示，各组覆盖度良好，组间比较显示，模型组Sobs指数较正常组显著降低（P<0.05），模型组Ace指数、Chao指数较正常组显著降低（P<0.01）;而观察组Ace指数、Chao指数较模型组显著升高（P<0.05）。提示MS可以导致肠道菌群丰度下降，而给予柴芪汤干预后能够提高肠道菌群物种丰度。

2.2 物种组成分析

1）主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）得分图中样本组成差异的解释度值主坐标值1（Principal Coordinates 1，PC1）、主坐标值2（Principal Coordinates 2，PC2）、主坐標值3（Principal Coordinates 3，PC3）分别为46.76%、20.58%、11.72%，其中模型组样本与正常组样本完全分开，观察组样本更接近于正常组，证明MS大鼠的肠道菌群结构较健康正常大鼠发生了较大变化，而柴芪汤能够促进肠道菌群组成结构的恢复。见图2。2）门水平下各样本肠道菌群组成结构情况见图3，所有样本共检测到细菌菌门6个，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）参与构成菌群的主要部分，模型组较正常组厚壁菌门/拟杆菌门比例升高，同时放线菌门（Actinobacteria）相对丰度增加，观察组肠道菌群结构与正常组类似。3）LEfSe分析得出的多级物种层级树图见图4，模型组较正常组有57个菌属发生改变，包括Anaeroplasma、Bacteroides_pectinophilus_group、Muribaculum、norank_f_Christensenellaceae、Pygmaiobacter、Ruminiclostridium、Papillibacter、Ruminiclostridium_6、Ruminococcus_1、Odoribacter、Ruminiclostridium_1、Helicobacter、Ruminiclostridium_9、norank_o_Mollicutes_RF39、norank_f_Flavobacteriaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group、Clostridium_sensu_stricto_1、norank_f_Erysipelotrichaceae、Elusimicrobium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Alistipes、Tyzzerella、Harryflintia、norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group、norank_f_Muribaculaceae、Barnesiella、unclassified_f_Clostridiaceae_1、Intestinimonas、Oscillibacter、Ruminococcaceae_UCG_013、Ruminococcace-ae_UCG_010、Prevotella_1、unclassified_p_Firmicutes、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Candidatus_Saccharimonas、Blautia、Holdemania、Erysipelotrichaceae_UCG_003、Negativibacillus、Phascolarctobacterium、Ruminococcaceae_UCG_008、Anaerostipes、Sutterella、Ruminococcus_torques_group、unclassified_f_Lachnospiraceae、Enterococcus、Ruminococcus_gauvreauii_group、Candidatus_Stoquefichus、Fusicatenibacter、Globicatella、Clostridium_innocuum_group、Coprococcus_3、Lachnospiraceae_UCG_001、Streptococcus、Lachnospiraceae_UCG_010、Faecalitalea、Lachnoclostridium、Anaerofustis。而柴芪汤能够将其中54个菌属调回至正常水平，并能将Parabacteroides、Erysipelatoclostridium、Roseburia、Catabacter、Family_XIII_UCG_001、cBacteroides 6个菌属的相对丰度提高至正常水平以上。

3 讨论

人类体内的微生物群由多达10～100万亿微生物组成，而这个数字比构成人体的细胞至少多10倍，这意味着构成人体的细胞中有10%是人类的，90%是微生物的。肠道微生物群提供了我们人类新陈代谢无法完成的重要代谢和生物学功能，并在宿主能量稳态和代谢功能中起重要作用。研究表明，肠道菌群通过影响能量平衡[12-14]、葡萄糖代谢和与肥胖和相关代谢紊乱及低度炎症反应[15-17]参与全身代谢，其可能途径包括参与能量和物质代谢，调节炎症反应信号通路，干预免疫，影响肾素-血管紧张素系统等。肠道菌群在代谢性疾病的发病过程中扮演了重要角色，这使我们看到了调节肠道菌群在针对MS及其相关并发症的治疗干预中的潜在重要性。本课题组前期研究发现具有疏肝健脾作用的柴芪汤能够改善MS大鼠的代谢异常状态，结合中医对脾胃功能的认知与肠道菌群功能的重合性，我们推测肠道菌群可能是柴芪汤防治MS的关键，故本研究采用16S rRNA高通量测序技术探究柴芪汤对MS大鼠肠道菌群组成结构的影响。

Alpha多样性分析一般用于微生物群落的丰富度和多样性分析，其结果为一系列统计学分析指数，其中丰富度指数包括Sobs、Ace、Chao，多样性指数包括Shannon、Simpson。经过统计学分析，我们发现MS大鼠丰富度指数（Sobs、Ace、Chao）显著降低，而多样性指数与正常组和观察组比较差异无统计学意义，说明MS发病过程中伴随着肠道菌群物种丰富度水平的下降，但是同时伴随着其他菌群相对丰度异常升高，造成其均匀度相对较高，因此其多样性指数变化不明显。而柴芪汤可以明显提高其物种丰富度，与前期研究中证实的其对MS代谢异常的改善作用相一致[4]。

LEfSe多级物种差异辨别分析发现MS大鼠与正常健康大鼠比较，有57个菌属发生相对丰度改变，其中35个菌属相对丰度下降，22个菌属相对丰度升高。针对其中数据库可明确分类识别的菌属分析发现，相对丰度下降在门水平下拟杆菌门（Bacteroidetes）为主，其相对丰度减少是宿主肥胖的重要原因[18]。而在科水平下拟杆菌门中以Muribaculaceae菌科下降最明显，后者参与宿主复杂碳水化合物（尤其是植物多糖）的代谢，其下降可能与饮食结构改变密切相关;同时下降明显的还有瘤胃菌科（Ruminococcaceae）下的Ruminiclostridium、Ruminiclostridium_1、Ruminiclostridium_6、Ruminiclostridium_9、Ruminococcaceae_UCG_013、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcus_1菌屬，该类菌属能够发酵抗酶解淀粉、膳食纤维和低聚多糖，产生丁酸盐，后者是短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFA）的一种，并且有研究证实上述菌属能够减缓非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）的进展，其可能机制为通过其代谢产物丁酸盐实现，后者具维持肠道屏障功能、维持肠道菌群平衡、调节免疫、抗炎等作用[19-22]。同时丰度下降菌属中Clostridium_sensu_stricto_1、Intestinimonas、Barnesiella的代谢产物也以SCFA为主[23]。Prevotellaceae_NK3B31_group、Candidatus_Saccharimonas具有抗炎作用，其丰度下降可能会导致炎症介质的过度表达。Odoribacter已被证实其丰度与肥胖妊娠期女性的收缩压、纤溶酶原激活物抑制剂-1浓度负相关[24]。其余菌属如Prevotella_1、Alistipes、Rikenellaceae_RC9_gut_group丰度的降低也与NAFLD相关[25]。相对丰度升高的菌属以毛螺菌科（Lachnospiraceae）为主，有学者发现非酒精性脂肪肝患者的粪便中毛螺菌科显著高于正常人，提示其可能与脂质代谢密切相关[26]。同时升高的还有Erysipelotrichaceae菌科，该菌科微生物群成员与代谢紊乱的临床指标显著相关，这可能与其释放的脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）介导的炎症反应有关[27]。在属水平下，与炎症反应相关的Blautia、Enterococcus、Negativibacillus相对丰度升高;代谢产物为三甲胺（Trimetlylamine，TMA）的Phascolarctobacterium、Anaerostipes[28]相对丰度升高，TMA可在肝脏中氧化形成具有促动脉粥样硬化形成作用的氧化三甲胺（TMAO）;Lachnoclostridium、Streptococcus、Holdemania、Ruminococcus_gauvreauii_group的富集则与脂质代谢异常密切相关[29-31]。而柴芪汤能将上述菌属中的54个菌属调回至正常水平，证明其对肠道菌群的重要调节作用。

本研究采用16S rRNA高通量测序技术研究了MS大鼠肠道菌群组成结构的变化及柴芪汤对其的干预作用，在属水平下鉴定了57个丰度显著改变的菌属。研究发现在饮食诱导的MS发病过程中，肠道菌群的组成结构发生了巨大的变化，主要以与SCFA、LPS、炎症反应、TMA、脂质代谢相关的菌属变化为主，验证了肠道菌群在MS及其并发症发病过程中的重要作用。同时研究证明柴芪汤能够逆转这种菌群结构异常，验证了柴芪汤对MS菌群失调的改善作用，但其调节肠道菌群的具体机制及通过菌群纠正MS代谢异常的机制还有待进一步研究。

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（2020-04-02收稿 责任编辑：芮莉莉）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81273695）

作者简介：彭龙（1992.02—），男，博士，研究方向：中医药防治代谢综合征，E-mail：772699670@qq.com

通信作者：张立平（1963.11—），女，博士，教授，研究方向：中医药防治代谢综合征，E-mail：lpzhang2005@126.com