兽医眼表移植学及植片材料的研究进展

2021-06-30胥辉豪郑小波冯雪倩慎晓军龚雨豪林珈好金艺鹏林德贵

畜牧兽医学报 2021年6期

胥辉豪，郑小波，杨恒，唐静，冯雪倩，慎晓军，龚雨豪，林珈好，金艺鹏，林德贵

(1.西南大学动物医学院，重庆 402460； 2.西南大学发光分析与分子传感教育部重点实验室，重庆 400700； 3.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

近年来，随着我国国民物质与文化水平的急剧提升，动物医学诊疗行业发展迅猛。同时，教育部关于动物医学专业认证标准以及中国畜牧兽医学会小动物医学分会对于诊疗行业专科考核机制的逐步推行，使得动物医学的人才培养与行业发展已经走向更为专业的专科化道路。在人类医学或动物医学领域中，眼科学都是极其独立且精细的一门医学专科，而角膜作为眼球重要的屈光与屏障器官[1]，其生理与病理变化以及治疗手段尤其受到广泛关注。外伤[2]、病原体[3]、自身免疫性疾病[4]等多种刺激因素均可导致动物角膜出现不同程度的病变，其结果可严重影响视力，甚至威胁眼球。

角膜具有独特的组织结构与免疫特点，尤其“免疫特赦”的生理独特性，让多种移植手术更具可行性，也使之成为移植手术中成功率最高的器官。但角膜各层结构对疾病的反应以及愈合的特点各不相同[5]，总体而言，眼表移植手术最终治疗目的分为治疗性移植术和光学性移植术，前者主要维持角膜的完整性，而后者则主要针对功能的保留。经过几十年的探索研究与临床实践，动物医学领域针对各种眼表疾病总结出了不同的治疗方法，对于绝大多数角膜病变，眼表移植手术是稳定角膜形态、维持眼球完整性以及恢复一定透光度的首要治疗手段。但对于各种移植手术以及移植物的适应症、生物相容性、预后特点等方面则需综合考虑，以期达到最佳的预后。本文就眼表移植学以及植片材料在兽医眼科的应用现状与展望进行综述，并对兽医眼科学中各种移植方法与材料的适应症和疗效进行讨论。

1 眼表移植术的角膜适应症

角膜是眼球自身的第一道组织结构屏障，并为眼球提供了2/3以上的屈光率。各种病因导致动物角膜受累的性质与程度各异，涉及到角膜严重缺损(例如角膜深度溃疡、后弹力层膨出、角膜穿孔等)、角膜增生性病变(例如眼表肿瘤、皮样囊肿、坏死性角膜炎等)、严重角膜感染(角膜基质层脓肿、角膜真菌感染等)和角膜透光度下降(角膜内皮功能障碍以及视轴区的严重瘢痕、矿物质沉积、黑色素沉积等)等情况需要对角膜修剪或切割后进行移植物填充。根据病灶侵害角膜的深度和面积选择合理的术式以及移植材料以最大限度维持角膜形态与功能。

2 眼表移植术与植片材料的临床应用

眼表移植技术主要利用各种手术技术对角膜病灶进行修复，经过不断地探索与改良，目前，术式大体上主要分为角膜板层移植、角膜全层移植和角膜内皮移植。选择不同性质的移植材料修补角膜缺损，根据移植物的来源和性质，可分为自体、同种异体、异种异体和生物工程材料。

2.1 自体来源材料眼表移植

利用受体动物自身眼球组织结构对角膜病灶或缺损进行移植或修补是较为传统的治疗手段。常利用的组织包括球结膜与睑结膜(conjunctival graft)甚至第三眼睑，此类材料最主要的治疗目的是用于填充角膜缺损、促进角膜愈合以及保护角膜。在20世纪50年代早期，首次报道了使用结膜组织修复动物角膜深度损伤与穿孔[6-7]，至今仍然作为常规治疗手段应用于兽医眼科临床。该类术式与材料具备的优点：1)取材方便且技术要求相对不高，同时对植床无较高需求标准，可直接用于原始角膜缺损病灶；2) 结膜组织具有一定的张力和较为丰富的血管分布，可提供良好的支撑保护作用和血液供应，促进角膜愈合；因此，该术式广泛应用于各种动物角膜的治疗性移植中。但由于结膜组织结构与角膜差异性大，无论从组织厚度、纤维走向、弹性张力还是透光度等方面，两者难以达到解剖学的一致性，故在恢复期将存在明显瘢痕，角膜表面不平整，血管明显残留等弊端。第三眼睑遮盖术尽管严格上来说属于暂时性眼表遮盖，但作为最原始的眼表疾病治疗手段，对浅层的角膜疾病有一定的治疗效果[8]。

随后，根据不同的适应症演变出各种类型的结膜瓣术式用于治疗动物角膜疾病，包括带蒂结膜瓣[9-10]、岛状结膜植片移植[11-12]、推进式结膜瓣[13]以及360°结膜遮盖[14]等。近年来，有学者提倡结膜瓣不仅用于修补角膜缺损，还可用于大疱性角膜病变的治疗[15]，以此改善角膜的长期水肿。在猫坏死性角膜炎中，部分学者建议长期保留狭窄的结膜皮瓣根部以维持治疗效果并防止疾病复发[16]，但该方法造成了结膜组织长期停留于角膜表面并持续为角膜组织供应血液，难以同时达到光学性治疗目的，尤其对于大面积角膜修复的病例。第三眼睑遮盖术目前多为眼表移植术的辅助性治疗手段，主要为了加强角膜塑性和保护。此外，对于单纯的大疱性角膜病变也可起到较好的独立治疗效果。

自体或同种异体板层角膜巩膜移植术(corneoscleral transplantation, CST)是针对角膜，尤其涉及角巩膜缘区域病灶的板层移植技术[17]，该技术为眼表黑色素瘤提供了有效的治疗思路，尽管术后可能出现轻微和短暂的并发症，但能够保留眼球的解剖与视觉功能[18]。而自体板层角膜结膜移植术(corneoconjunctival transposition, CCT)是在自体板层角膜巩膜移植的基础上改良而来的眼表移植技术，在切除病理性角膜基质层后将周围健康角膜与结膜组织平行移植到受体基质植床中[19]。对于视轴区角膜基质存在坏死、严重矿物质沉积、瘢痕或黑色素沉积等情况可采用该术式。其主要优点在于取材方便，维持了中央角膜区域的透光度和曲率，无免疫排斥反应。但外周健康角膜区域平移后需要临近结膜组织替代，后期会残留一定瘢痕化。临床中，自体板层角膜结膜移植术主要用于猫坏死性角膜炎的治疗中。一项大型回顾性研究表明，CCT可用于猫各种厚度的角膜缺损，术后坏死复发率较传统的结膜瓣手术低(8.3%)[20]。但平行移植的角膜组织中可能仍然潜伏疱疹病毒，具有潜在坏死病灶复发的可能。同一位点进行二次手术具有一定风险性，尤其当外周角膜厚度下降时，应更换切割角膜的象限来避免穿孔。此外，对于其他物种的动物较为严重的角膜疾病，CCT也可作为治疗方式之一。对于深基质层角膜溃疡、后弹力层膨出等非全层角膜损伤的适应症，大部分病例术后可获得植片区域透明或部分透明，但色素细胞和血管化可通过结膜组织引入角膜中[21]。原则上该术式适用于病灶面积小于角膜直径25%～30%的适应症[22]，最新临床报道表明，当病灶面积较大时，可选择桥式角膜结膜平移的方式分别从病灶对应的两端向中央取材并汇合，以保证视轴区角膜植片的供应[23]。总体来说，该术式能够尽量满足瞳孔区域角膜的形态与功能，当外周保留足够健康角膜作为供体时，可作为较为理想的板层移植手段，对操作技术有一定要求。

2.2 异体来源材料眼表移植

多年来，各种异体来源组织材料被广泛研究并应用于动物眼表移植学中，以寻找更为理想且来源更为便捷、丰富的移植材料。同种异体角膜移植是最具代表性的经典眼表移植手术，该方法的研究可追溯至20世纪[24]。其保证了植片物种间的一致性，具备相同的组织结构与解剖特点，可根据适应症选择不同厚度的角膜植片，最终达到理想的治疗与光学效果。在理想的情况下，优先选择新鲜角膜供体，新鲜组织被认为是成功进行同种异体角膜移植的必要条件，但储存时间有限(4 ℃冷藏条件下不超过48 h)[25]；此外，国外具有动物眼库，在1个月到1年的时间范围内可选择犬、猫以及马等物种的冷冻角膜进行移植手术[26]。尽管天然角膜植片是最佳的移植材料，但由于角膜组织来源具有较大局限性，而兽医眼库数量也非常有限，因此限制了新鲜角膜或冷冻角膜在兽医临床的广泛应用。

根据适应症的不同，同种异体角膜移植分为板层移植和穿透性移植两类。全层角膜移植是传统的眼表移植技术，通过全层角膜置换来获取完整角膜结构并维持移植区角膜光学功能。该方法可有效治疗动物严重、全层角膜疾病，该术式开发的早期主要针对内皮功能障碍的病例。国内外学者均成功将该方法用于治疗动物角膜疾病。由于该术式导致眼内组织暴露且损伤相对较大，故术后并发症明显，主要包括植片排斥、创口撕裂、青光眼、前房积血、葡萄膜炎等[27-29]。与人类一样，尽管来自同种异体的角膜植片在本质上避免了异源性，但仍然有多个因素决定着术后植片的存活，如角膜血管化程度、植片大小、是否偏中心移植、缝合技术等[30-31]。此外，由于同种异体来源的全层角膜植片含有大量细胞组分，其中上皮、角膜细胞是主要组织相容性复合体(MHC)抗原和次要H抗原，尤其是新鲜角膜供体植片主要针对角膜上皮细胞和内皮细胞，因此相对具有更大的排斥风险。研究显示，犬高危穿透性角膜移植术的排斥发生率高于板层移植(分别为57%和55%)[27]。

随着科技的进步，异体天然角膜板层移植在兽医眼科学中逐渐具有广泛的适应症。对于未全层角膜损伤的病例，在技术与设备可行的前提下，均可使用该术式进行治疗。异体板层角膜移植可维持角膜的结构和光学功能，其并发症主要包括植片脱落、溶解和色素化[32]。在人眼科学和比较医学的不断深入发展与研究的进程中，更多术式被引入到了动物板层角膜移植中。Archila[33]于1984年正式提出深层板状角膜移植术(deep lamellar keratoplasty，DLKP)的概念[33]，将该技术定义为完全切除病理性角膜基质组织至后弹力层，随后将无内皮的供体角膜移植到宿主植床中。与传统LKP中基质与基质的对合方式相比，该术式中基质与后弹力层的对合方式更符合角膜的解剖结构，更利于角膜透明度的恢复。在马属动物角膜的一些倾向性适应症中(易出现真菌性角膜炎或角膜基质脓肿)，还可选择后板层角膜移植术进行治疗。临床结果显示，尽管同种异体的后板层角膜移植病例术后部分出现了排斥反应，但最终取得了良好效果，与穿透性角膜移植无显著差异[34]。为了更为精准暴露后弹力层，在兽医眼科学中，将大泡辅助分离切割技术应用到了深板层角膜移植术中，该技术的应用更有利于动物深部角膜基质层的切割，由于减少了角膜组织的抗原数量，相关临床报道称术后未见免疫排斥反应[35]。

2.3 其他组织来源材料眼表移植

一直以来，兽医基础医学与临床医学不断研究与摸索将机体各种组织来源的材料用于眼表移植，以期筛选出方便获得、具有修补效果和维持角膜光学功能的替代移植物。羊膜作为胎衣的一部分，由于其免疫、生理等特点，早在20世纪初就广泛应用于各种临床手术中[36]。羊膜具备无血管，抗炎、促进上皮化、抗纤维化、抗蛋白酶和生长因子等特征[37-39]，也广泛应用于兽医临床的眼表移植修复手术中。根据材料来源，新鲜羊膜和储存羊膜均可使用[40]，但由于制备工艺略微复杂以及厚度较薄制约了适应症[41]。对于角膜上皮包涵体、皮样囊肿等浅表性角膜疾病，使用羊膜移植能够促进角膜迅速愈合[42-43]。早期报道称马胎衣羊膜用于犬角膜全层异种移植时引起显著肉芽组织增生和植片不透光，但可作为结构性移植物修补犬全层角膜缺损，推荐在外周角膜病变时使用[44]。近年来的临床研究表明，使用人、牛来源的冷冻保存羊膜治疗犬复杂性角膜溃疡(后弹力层膨出、角膜溶解、角膜穿孔等)取得了高度满意的视力和美观效果[45]。

此外，其他组织来源的膜状结构也用于兽医眼表移植中，有报道使用牛心包膜治疗犬深度溶解性角膜溃疡和猫坏死性角膜炎，83%的植片与角膜融合，但产生局灶性角膜瘢痕[46]。在使用甘油保存的马肾包膜对犬角膜进行板层移植手术中，植片术后的中、后期出现了水肿、血管浸润和炎性渗出，但最终逐渐消退，提示其可作为犬角膜板层病变移植手术的替代组织[47]。也有报道将保存的同源性腹膜用于移植来治疗先天性巩膜葡萄肿，最终减少了眼球斜视程度和葡萄肿大小，改善了眼睛外观[48]。此外，自身大腿皮下筋膜也曾用于眼表移植来治疗犬角巩膜缘处的巩膜破裂，术后植片与组织良好融合且未见明显炎性反应，最终动物保留了美观、舒适且具有功能的眼球[49]。对于涉及到角巩膜大面积的缺损，为了保留眼球，甚至还可以移植非膜性组织。有报道曾分别使用自体耳廓软骨和第三眼睑T形软骨联合结膜瓣对犬和猫的眼表黑色素瘤进行了穿透性眼表移植术，术后未见任何排斥反应，成功修复了眼球壁和角膜缺损，动物长期保持视力。该方法可减少传染性病原体(疱疹病毒)的医源性传播，对于角膜巩膜大面积损伤可能是一种值得考虑的手术方法[50-51]。

脱细胞工艺处理的修补材料多年来广泛应用于兽医眼科临床中。通过理化和酶处理过程可获得各种黏膜的脱细胞胶原生物支架[52-53]，该类产品对细菌敏感性低、抑制金属蛋白酶活性并具有低抗原性[54-56]。Lewin[57]于1999年首次报道将猪小肠黏膜下层用于治疗犬角巩膜全层缺损。目前成熟商业推广并应用的材料主要包括猪小肠黏膜下层(SIS)、猪膀胱基质(UBM)和猪膀胱黏膜下层(ACell)。SIS制品可应用于各种病因导致的动物角膜、巩膜缺损甚至穿孔[58-59]。尽管植片厚度单一，但可通过叠加多层移植物的方式来填充不同深度的缺损。术后可维持角膜形态，但可能会遗留部分疤痕或黑色素沉积，是传统结膜移植的较好替代品[60]。同样，也有临床报道在马属动物中使用UBM治疗感染性角膜溶解，术后94%的术眼具备视力，但均发生角膜炎，建议该产品也可作为马属动物眼表移植的替代品，具有商业可用和便于储存的优点[61]。在一项使用猪膀胱黏膜下层对犬、猫进行角膜移植的大型回顾性研究中，72%的术眼具有轻微和中度的瘢痕，23%的植片出现脱落，6%的术眼出现眼球痨、青光眼等并发症。该移植物同样也是角膜移植的一种替代产品，在猫中瘢痕较小，但移植物裂开率较传统技术更高[62]。此外，对于严重角膜损伤或角膜穿孔的病例，结膜瓣联合脱细胞生物补片可增强角膜稳定性，进而提升治疗效果。据报道，猪小肠黏膜下层与结膜瓣遮盖术联合治疗犬、猫和马的角膜全层创伤中，93%的病例获得了积极的视觉效果[63]。

3 眼表移植术与植片材料的进展与展望

经过数十年的研究与临床应用，尽管有多种眼表移植技术以及材料可供兽医眼科临床选择，但为了尽可能地以最精准的治疗手段达到最佳的角膜组织兼容性和光学效果，兽医眼科学领域始终在不断探索与研究眼表移植术式与植片材料。

3.1 角膜内皮移植技术

角膜内皮细胞担负着为角膜持续脱水的重要生理作用，但其极为有限的有丝分裂能力导致无法实现有效的细胞再生。内皮细胞功能障碍所导致的角膜疾病在兽医眼科临床中较为常见，细胞失代偿而出现的脱水功能下降可导致动物角膜出现不可逆的高度水肿，严重影响视力，并易出现大疱性角膜炎、角膜穿孔等并发症。手术移植目前仍是最为有效的治疗手段。传统全层角膜置换尽管可提供健康的角膜内皮细胞，但并非针对病灶进行精准医学治疗，且对整个角膜组织损伤较大，增加了术后免疫排斥的风险，因此，角膜内皮移植是最佳的针对性治疗手段。尽管该技术在人类医学中的应用已经较为成熟，但由于经验技术以及设备需求等因素，角膜内皮移植术在兽医眼科中仍处于摸索阶段。Brooks等[64]曾对66匹马进行了深板层内皮移植术(deep lamellar endothelial keratoplasty，DELK)，其中89.4%的马匹获得了有效视力。Armour等[65]对一例患有角膜内皮营养不良的10岁波士顿梗进行了更为精准的受体角膜后弹力层撕除-角膜内皮细胞移植术(descemet’s-stripping endothelial keratoplasty，DSEK)，术后一年移植区域与植床边缘均保持透明。角膜内皮移植技术的日趋成熟将为兽医眼表移植学提供更多的治疗选择与更广阔的前景。

3.2 新型组织工程角膜

一直以来，天然角膜供体的匮乏始终是眼表移植手术中存在的困扰。人眼科学和兽医眼科学领域始终在不遗余力地研究与开发最接近天然角膜的完美替代品[66]。其中角膜基质层所占厚度比例最高，同时临床适应症相对较多且更容易研究与开发，故针对异种角膜的基质脱细胞材料是目前研究最多也为最成熟的组织工程角膜材料。我国自主研发的新型组织工程角膜(BioCorneaVetTM)已经用于兽医眼科临床中。该材料同样是基于细胞支架的原理，通过病毒灭活、脱细胞和灭菌等手段获得猪角膜细胞外胶原基质[67]。具备可长期储存、使用方便以及随意切割等优点。适应症包括各种病因导致的角膜基质层不同深度的缺损；在全层角膜损伤中，也可作为塑形支架用于构建角膜形态。近年来，组织工程角膜用于板层移植治疗犬高危角膜损伤病例取得了理想效果，术后5个月植片恢复透明，未见免疫排斥和炎性反应[68]；在对兔的板层角膜移植中，组织工程角膜同样显示出了良好的组织相容性，术后32周恢复了正常的角膜组织结构，且受体角膜完全透明[69]。前期临床结果显示出了其强大的角膜修复能力和光学效果，相信随着更为深入的研究与多物种、大量临床病例的效果观察，组织工程角膜有望成为兽医眼科临床中最具前景的移植材料。

3.3 角膜移植术中光学相干断层扫描与飞秒激光

在现代眼科学中，涌现了各种进步的技术用于辅助提升眼表移植的疗效，其中最为重要的手段为术中光学相干断层扫描(iOCT)和飞秒激光。

iOCT可提供受体与供体角膜组织精确的厚度数据，并在术中给予切割引导，实时识别薄弱的角膜区域，保证最大限度地安全切割深度以避免角膜穿透，在各种非全层角膜移植的手术中极为有用。同时，通过iOCT可轻易发现植片轻微剥离、错位以及界面碎片等显微镜下易忽略的细节[70]。飞秒激光可辅助板层角膜移植术(FALK)，以及穿透性角膜移植。不同于人工钻取，飞秒激光可制备不同形状且完美匹配的植片与植床，这将尽可能减少角膜损伤、有利于伤口愈合以及减少术后散光。

上述移植技术与手段已经较为成熟地应用于人类眼表移植学中，但由于成本因素，目前还未在兽医眼科临床中广泛推广，相信随着行业的不断发展，在不久将会逐步运用于兽医眼科学中。