不同活体饵料对斑马鱼幼鱼发育的影响*

张佳怡，周宇航，高 翔，刘 东，巩 杰

（南通大学生命科学学院，江苏226019）

斑马鱼与人类基因具有高度同源性，在生物学、遗传学、肿瘤学、免疫学、解剖学等诸多领域做出重要贡献[1]，在中药研究及各类疾病研究中得到广泛应用[2-5]。如今将斑马鱼作为实验动物普遍养殖，斑马鱼幼体培养阶段至关重要，选择优质饵料十分关键。活体饵料可促进斑马鱼的生长和性腺发育，缩短性腺成熟时间[6-7]，是斑马鱼主要食物来源。吴兴兵等[7]分别使用丰年虫、冰冻轮虫、水蚯蚓和人工配合饲料作为开口饵料对四川裂腹鱼仔鱼进行投喂实验，发现丰年虫能保证仔鱼较快生长速度和较高成活率。草履虫和丰年虫的无节幼体是目前实验室饲养斑马鱼幼鱼的优质活体饵料[8-9]，但大多认为丰年虫不适合作为斑马鱼幼体的开口饵料，因为早期幼鱼的开口小，难以摄取丰年虫。轮虫是大多数经济鱼类最优质的开口饵料之一[10-12]，是否能作为斑马鱼幼体的开口饵料值得探究。为了探究斑马鱼幼体更合理的饵料及投喂方式，本实验选择草履虫、丰年虫和轮虫三种活体饵料，探究不同饵料及其组合对斑马鱼幼鱼生长发育的影响，以期筛选出适宜斑马鱼幼体生长的活体饵料，供实验室养殖时饵料选择参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：斑马鱼由南通大学实验动物中心提供［SCXK（苏）2019-0001/SYXK（苏）2017-0045］，使用野生型（AB）品种斑马鱼内交产生后代进行培养。所有实验操作在南通大学实验动物中心完成，符合江苏省实验动物管理委员会伦理规范，遵循3R原则，动物实验伦理审批号为20200711-001。

1.1.2 饵料来源：草履虫来自实验室培育，酵母粉经实验室培育斑马鱼所用水溶解并过滤后投喂；丰年虫为现孵现用，人工配置海水，于孵化器内孵化干燥丰年虫卵24～36 h后，收集丰年虫无节幼体；轮虫为网上购买活体，投喂小球藻和酵母进行培养和繁殖。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：挑选受精后5天（5 dpf）活泼健康的野生型（AB）斑马鱼幼鱼，随机分为7组，饥饿组：不投喂任何食物；草履虫组：以足量草履虫作为饵料；轮虫组：以足量轮虫作为饵料；丰年虫组：以足量丰年虫作为饵料；草履虫+丰年虫组：以足量草履虫和丰年虫作为饵料；轮虫+丰年虫组：以足量轮虫和丰年虫作为饵料；轮虫+草履虫组：以足量草履虫和轮虫作为饵料。每组分为4组重复。

1.2.2 实验方法：每个养殖容器中放养斑马鱼幼体20尾，加入400 mL实验室培养斑马鱼所用系统水（水温28℃，电导率500～550 S/m，pH值7～7.5，硬度100 mg/L CaCO3，盐度0.25～0.75 ppt）。每日于上午9：00，下午5：00喂食2次。将丰年虫和轮虫置于300目筛网上用系统水冲洗3 min，然后收集于烧杯中，用系统水稀释后采用滴管投喂。每日下午7：00对饲养容器吸污，换水，换水量为150 mL，换水后观察幼鱼存活率及生长情况。对投喂丰年虫组别（丰年虫组、草履虫+丰年虫组、轮虫+草履虫组），每日上午喂食2小时后观察摄食丰年虫幼鱼的数量（斑马鱼幼鱼摄食丰年虫后腹部出现明显红或橙色），记录摄食丰年虫幼鱼的比例，直到全部幼鱼开始摄食丰年虫为止。每隔10天从各处理组随机取3条幼鱼，采用Leica QWin V3拍照，测量幼鱼体长。40 dpf天后结束实验，测量各组每条鱼的最终体长和体质量。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同饵料对斑马鱼幼体存活率的影响 实验最开始时各组存活率都较高，10 dpf后饥饿组斑马鱼幼体开始大量死亡，至14 dpf幼鱼全部死亡。草履虫组、草履虫+轮虫组10～12 dpf存活率有所下降，13～25 dpf幼鱼死亡率无显著增加，从26 dpf开始存活率再次显著下降。草履虫+丰年虫组10～14 dpf存活率有所下降，之后存活率始终保持高水平。单独投喂丰年虫组从11 dpf开始出现明显死亡，但34 dpf后直到试验结束未再出现死亡，最终存活率在7组中居第2位。轮虫+丰年虫组在9 dpf开始出现死亡，最终存活率居丰年虫组之后。单独投喂轮虫组从10 dpf开始直到实验结束持续存在死亡现象。添加丰年虫各组最终存活率分居前3位，高于未添加丰年虫各组。见图1。

图1 斑马鱼幼鱼存活率

2.2 斑马鱼幼体摄食丰年虫情况 8 dfp前丰年虫组、草履虫+丰年虫组和轮虫+丰年虫组所有幼鱼都无法摄食丰年虫，到9 dpf后3个组均出现能摄食丰年虫的斑马鱼幼鱼，其中草履虫+丰年虫组中摄食丰年虫的幼鱼比例最高，单独投喂丰年虫组次之，轮虫+丰年虫组最低。全部幼鱼摄食丰年虫所需时间明显不同，13 dpf时草履虫+丰年虫组所有幼鱼摄食丰年虫，而单独投喂丰年虫组和轮虫+丰年虫组分别需要发育到22 dpf和20 dpf。见表1。

表1 斑马鱼幼鱼摄食丰年虫比例（%）

2.3 不同活体饵料对斑马鱼幼鱼生长的影响 分别在5 dpf（实验开始当天）、20 dpf、30 dpf和40 dpf随机对各处理组斑马鱼幼鱼进行拍照对比，图2中每个时间点鱼的排列顺序从左到右为草履虫+丰年虫组、轮虫+丰年虫组、丰年虫组、轮虫+草履虫组、草履虫组和轮虫组。实验开始时各组幼鱼体长相当，随着不同饵料的投喂，幼鱼生长速度出现显著差异，投喂草履虫+丰年虫的幼鱼长势最好，体长最长，其次为投喂轮虫+丰年虫组以及单独投喂丰年虫组，未投喂丰年虫的3个组幼鱼体长显著小于投喂丰年虫组，并且随着幼鱼不断发育愈加明显。

图2 不同时间点斑马鱼幼鱼成像

40 dpf后对各组存活的全部斑马鱼进行体长及体质量测量，发现单独投喂轮虫组鱼体体长和体质量最小，而草履虫+丰年虫组鱼体生长状况明显优于其他组，投喂丰年虫的3个组（丰年虫组、草履虫+丰年虫组、轮虫+丰年虫组）鱼体体质量和体长均显著高于未投喂丰年虫组（草履虫组、轮虫组、草履虫+轮虫组）。见图3、图4。

图3 不同处理组斑马鱼幼鱼平均体长

为了探究不同饵料投喂对整个试验期间斑马鱼幼鱼生长的影响，我们每隔10天测量各组幼鱼体长，结果10 dpf前所有投喂草履虫的实验组中幼鱼生长速度显著高于未投喂草履虫组，单独投喂草履虫组幼鱼体长增长速度与同时投喂草履虫和丰年虫组并无显著差异。10 dpf后草履虫+丰年虫组、轮虫+丰年虫组以及丰年虫组斑马鱼幼鱼体长增长速度显著增加，增加速度明显高于其它3组。同时，10 dpf后未投喂丰年虫的3组幼鱼生长速度显著减慢，几乎不再增长。见图5。

图5 不同处理组斑马鱼幼鱼体长增长曲线

3 讨 论

图4 不同处理组斑马鱼幼鱼平均体质量

饥饿是自然生态系统中影响水生动物正常生长、发育、存活的重要因素，充足的营养对水生动物尤其是小型变温动物的正常发育非常关键[13]。仔鱼期阶段是鱼类生活史中对环境条件最敏感、最脆弱时期，即使短时间的饥饿胁迫都能明显延长幼体的发育过程，并导致较高的死亡率[14]。仔鱼孵化出膜后首先吸收卵黄内营养物质，然而内源性营养物质有限，若不能及时持续获得食物，仔鱼将达到饥饿不可逆点而死亡[15]。本实验中饥饿组斑马鱼幼鱼生长速度低于轮虫或草履虫投喂组，仍能发育到9 dpf，从10 dpf开始出现死亡，至15 dpf全部死亡；单独投喂丰年虫组9 dpf前未见进食，部分幼鱼从10 dpf开始可以摄食丰年虫，死亡率显著低于饥饿组。说明斑马鱼幼鱼在9 dpf前可通过吸收内源性营养物质完成生长发育，之后内源性营养物质已无法满足生长发育的需要。

褶皱臂尾轮虫适应性强，生长快，营养丰富，易于培养，游动速度缓慢，在水产养殖中具有重要地位，广泛用作水产仔稚鱼及虾蟹甲壳类的开口饵料[10-12]。关于轮虫能否作为实验室斑马鱼幼鱼优质开口饵料的报道较少，本实验结果显示，尽管所用轮虫大小与实验室常用的草履虫相似，但投喂轮虫组斑马鱼幼鱼死亡率较高，在投喂草履虫同时添加轮虫并不能提高幼鱼存活率，对幼鱼体长和体质量生长无明显促进作用，无论是生长前期还是后期相较于草履虫甚至丰年虫，都处于明显劣势。在四川裂腹鱼饵料实验中也有类似报道[16]。表明轮虫不适合作为斑马鱼等鱼类的开口饵料。

在10 dpf前所有投喂草履虫各组幼鱼体长增速显著快于未添加草履虫组，表明草履虫是斑马鱼幼鱼早期的优质开口生物饵料[17]。但从10 dpf开始草履虫组和草履虫+轮虫组相较于投喂丰年虫各组幼鱼体长增速减慢，同时幼鱼最终体长、体质量显著低于丰年虫组，表明10 dpf后单一投喂草履虫已无法满足幼鱼生长的需求，需要补充其他饵料（如丰年虫）才能满足幼鱼发育需要[10]。此外，一开始保持较高存活率的草履虫组以及草履虫+轮虫组，从28 dpf开始死亡率显著增加，最终超过单独投喂丰年虫组，表明尽管草履虫可以作为斑马鱼幼鱼开口和早期适宜的饵料，但随着幼鱼不断发育而逐步丧失优势，原因是由于草履虫为低营养饵料，适用于鱼类幼体早期阶段[18]，无法为后期幼鱼提供存活所需的全部营养。

丰年虫游动速度适宜，便于鱼类捕食，且对鱼体生存水环境无污染，可以满足鱼类更高水平营养的需求，其卵在常温下长期干燥保存，可随时孵化使用，因而是实验室斑马鱼成鱼或幼鱼后期的重要饵料[17]。本实验发现，单独投喂丰年虫斑马鱼幼鱼也可正常发育，并且最终幼鱼的存活率、体质量和体长显著高于未投喂丰年虫组，但与投喂草履虫各组（草履虫组、草履虫+轮虫组和草履虫+丰年虫组）相比，单独投喂丰年虫组幼鱼从12 dpf开始出现大量死亡。此外，无论是丰年虫单独投喂组还是丰年虫与轮虫或草履虫组合投喂组，斑马鱼幼鱼都是在发育到9 dpf时才开始摄食丰年虫。由于丰年虫无节幼体的体长（约400微米）显著大于草履虫和轮虫，斑马鱼幼鱼在9 dpf前开口小，无法完整摄食丰年虫。单独投喂丰年虫组死亡率高，是因为部分幼体通过内源性卵黄物质无法生长到能摄食丰年虫的大小而饥饿死亡，未死亡幼鱼直至9 dpf或更晚才有外源营养物质摄入，但前期营养不足对鱼体已造成一定程度伤害，进入不可逆生长点而最终死亡[15]。本实验还发现，在11 dpf时单独投喂丰年虫组中摄食丰年虫比例仅（39.6±10.0）%，而草履虫+丰年虫组为（92.2±4.1）%，当幼鱼发育到40 dpf时，单独投喂丰年虫组的幼鱼平均体质量显著低于草履虫+丰年虫组，表明丰年虫尽管可以作为幼体时期唯一饵料，但存在一定的不足[19]。

本实验显示，10 dpf前单独投喂草履虫组与同时投喂草履虫和丰年虫组幼鱼体长增长速度无显著差异，之后投喂草履虫+丰年虫组以及单独投喂丰年虫组相较于单独投喂草履虫组，斑马鱼幼鱼体长增速显著增加，表明10 dpf后丰年虫可作为主要饵料满足斑马鱼营养需求，相比于草履虫可以提供更加丰富和高级的营养以供斑马鱼幼体生长所需，采用草履虫+丰年虫投喂的斑马鱼幼体，其生长占有绝对优势。因此，在9 dpf前单一投喂草履虫，从9 dpf开始添加丰年虫，13 dpf后可由丰年虫完全替代草履虫（此时幼鱼能100%摄食丰年虫）是实验室饲养斑马鱼幼鱼的最佳方式。