白介素-31基因多态性与隐睾发病易感性的相关性*

2021-06-30黄贵闽曹贵华唐铁龙谭春林

西部医学 2021年6期

黄贵闽曹贵华唐铁龙谭春林

(1.乐山市人民医院泌尿外科，四川乐山 614000；2.川北医学院附属医院，四川南充 637000)

隐睾是新生男婴最常见的先天性畸形之一，约30%的早产儿和3%～5%的足月儿患有隐睾[1]。隐睾是一种中度畸形，是发生不育和睾丸癌等并发症的重要危险因素。隐睾常常作为一种孤立性疾病发生，其发病机制尚不完全清楚，但可能是多因素的，涉及遗传和环境因素[2-4]。白介素-31(IL-31)是新近发现的GP130/IL-6细胞因子家族成员。IL-31主要由CD4+T细胞分泌。IL-31信号通过与IL-31受体A(IL-31RA)和抑瘤素M受体(OSMR)所组成的异源二聚体功能受体复合物结合而传导，能在不同程度上激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路[5-8]。促炎症细胞因子IL-31能够在众多免疫过程中诱导IL-6的分泌，而IL-6基因的表达水平与隐睾发病风险呈正相关[9-10]。因此，推测隐睾发病可能与IL-31相关。研究表明，IL-31参与了神经、免疫、生殖、呼吸、运动等系统相关细胞的生长和发育。但至今尚无IL-31与隐睾发病的相关报道。本研究中，我们探究IL-31基因rs7977932(C/G)和rs4758680(C/A)多态性在中国人群隐睾的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2010年1月～2015年12月在川北医学院附属医院和乐山市人民医院接受诊疗的隐睾患者。所选取的隐睾患者(仅为孤立性隐睾病例)和健康个体进行病例-对照研究。这些患者在出生后不久便进行体格检查，并在月龄3个月时再次进行检查，以确定其隐睾情况。选取同期该院就诊的无血缘关系并接受包皮切除术的健康人群作为对照组。早产儿、低出生体重婴儿和有其他严重疾病或系统性疾病个人史或家族史的个体均不被纳入研究范围之内。本研究应用刘毅东[12]提及的隐睾的定义和相关体格检查方法进行疾病的诊断。所有的检查都是在温暖的条件下对仰卧姿势的孩子进行。睾丸在其正常下降的路径上经过持续、稳定而非暴力的牵拉到最远端的位置后被记录为最终的睾丸位置。对于隐睾这一诊断在进行睾丸下降固定术前，即病人1岁左右时再次确认。在所有病例中，单侧隐睾97例，双侧隐睾15例。在双侧隐睾病例中，隐睾患者睾丸位置由两侧较高者决定并记录。共有32例、27例、24例、19例和10例隐睾患者的睾丸位置分别位于腹股沟浅囊、阴囊上区、外环口、腹股沟管和内环口。对照组人群均于川北医学院附属医院接受包皮切除术。所有研究对象(包括病例组和对照组)均为中国西南地区四川省的汉族人群。本研究经川北医学院附属医院、乐山市人民医院伦理委员会批准。所有研究对象的父母都得到书面同意书并签字同意参加这项研究，对每名隐睾患者和对照组抽取5毫升外周静脉血以备DNA提取。

1.2 DNA提取和基因分型分别对IL-31基因rs7977932和rs4758680两个单核苷酸多态位点(SNP)进行基因分型。每个样本的基因组DNA是适量EDTA抗凝外周血样品中采用DNA分离试剂盒(BioTeke，北京，中国)提取。操作程序按照制造商说明书执行。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法对所选的2个SNP进行基因分型。使用引物设计软件Primer 3设计引物(http://bioinfo.ut.ee/primer3-4.0/primer3/)，见表1。PCR反应体系中分别含PCR缓冲液，基因组DNA和0.1 μL的扩增引物等。待PCR反应结束后用相应的内切酶对产物分别进行酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色等步骤。最后再随机选取15%样本采用DNA测序方法重复测量，两次分型结果完全一致。

1.3 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。通过直接计数获得2个SNPs的基因型频率。采用卡方(2)检验对对照组人群进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。利用优势比(odds ratio,OR)和95%置信区间(confidence interval,CI)评价病例组和健康对照组在等位基因与基因型间差异。P<0.05为差异有统计学意义，所有统计检验均为双侧概率检验。使用在线软件SNPstats(https://www.snpstats.net/snpstats/)对此病例对照研究的基因型相关性检验，遗传模型分别包括共显性、显性、隐性和超显性。

2 结果

2.1 两组IL-31基因的单核苷酸多态位点等位基因频率比较本研究最终成功对112例病例组和425例对照组进行基因分型。对照组的IL-31基因多态位点rs4758680和rs7977932的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(rs4758680:2=1.44,P>0.05,rs7977932:2=0.62,P>0.05)。病例组和对照组的2个SNPs的等位基因频率分布情况，见表2。rs7977932位点的等位基因频率分布在病例组和对照组之间无显着性差异(P>0.05)。对rs 4758680而言，病例组rs4758680的C等位基因频率明显高于对照组(89%vs83%)；相反，病例组rs4758680的A等位基因频率较对照组有所下降(11% vs 17%)。隐睾风险显著降低与rs4758680位点的A等位基因相关(P=0.02，或=0.58，95% CI=0.37～0.92)。

表2 病例组及对照组IL-31基因的单核苷酸多态位点等位基因频率比较[n(×10-2)]Table 2 Allele frequencies of SNPs in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism risk

2.2 两组IL-31基因rs7977932基因频率比较对IL-31基因rs7977932位点基因多态性分析表明，病例组与对照组的基因型频率分布在共显性、显性、隐性和超显性遗传模型上均无统计学差异，见表3。

表3 病例组及对照组IL-31基因rs7977932基因型频率比较[n(×10-2)] Table 3 Genotype frequencies of SNP rs7977932 in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism

2.3 两组I-31基因rs4758680基因型频率分布 IL-31基因rs4758680位点基因型频率在共显性、隐性、超显性三种基因模型下，病例组与对照组相比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；而在显性基因模型中，病例组中CC基因型频率(79.5%)明显高于对照组中CC基因型频率(69.2%)；病例组中A碱基携带者(CA/AA基因型)频率在中显著低于对照组(20.5% vs 30.8%)，差异有统计学意义(OR=0.58,95%CI=0.35～0.96,p=0.03)，见表4。

表4 病例组及对照组IL-31基因rs4758680基因型频率分布[n(×10-2)] Table 4 Genotype frequencies of SNP rs4758680 in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism

3 讨论

人类的IL-31基因位于染色体12q24.13上，该基因可以编码一个由164个氨基酸组成的蛋白质[15]。IL-31是一种多向性细胞因子，具有造血调节、免疫、细胞增殖、细胞因子和趋化因子的诱导等多种生物学功能；IL-31及其受体通路在多种免疫和炎性反应中发挥其生物学功能，引起如炎症性肠病、类风湿关节炎、支气管哮喘和各型皮炎等在内的各种自身免疫疾病和变态反应性疾病[16-18]。Potashnik H等[19]人报道了在体外条件下，IL-6的分泌伴随着异常数量的睾酮，而性发育不成熟小鼠睾丸组织中IL-6基因表达水平显著高于其在成熟小鼠睾丸内的水平，故IL-6可能参与调节睾丸发育、生长、增殖和分化等重要生理功能。有趣的是，IL-31作为一种新近发现的炎症细胞因子，能够在多种不同类型的细胞中有效诱导促炎症介质的释放，而这其中就包括IL-6[17-18，20]。因此，我们猜测IL-31可能通过某种途径影响IL-6的释放，并有可能进一步影响隐睾的发展。

基因多态性包括DNA片段长度多态性、DNA重复序列多态性、单核苷酸多态性(SNP)等种类，且以后者最为多见。SNP可以作为疾病的病因、发病危险因素，也可做为肿瘤标记物、生物标记物诊断某疾病，而且在评估治疗方案的治疗效果，判断某个药物的不良反应及肿瘤的生存和预后等方面都有广泛的研究。目前国内外尚无IL-31基因多态性与隐睾发病易感性之间相关性的研究[21-23]。本研究首次探究并证实了中国人群隐睾发病易感性与IL-31基因多态性的相关性。本研究中所选择的两个IL-31基因的单核苷酸多态位点均位于内含子区域。对于rs4758680，在显性遗传模型中，患者与对照组之间的基因型频率分布差异具有统计学意义。虽然单核苷酸多态位点rs4758680位于非编码区，但其可能通过影响其他基因的表达产物而不是通过改变IL-31基因中的氨基酸序列影响IL-31的结构和功能进而改变隐睾发病的易感性。我们本研究所得到的数据与IL-31基因多态性扩张性心肌病及系统性红斑狼疮的遗传易感性的相关性研究结果相似[15,24]。越来越多的证据表明，位于非编码区的内含子可以通过一种特殊的机制启动和增强基因在广泛的生物群体中的表达，这种机制被称为内含子增强效应[25]。尽管本实验中单核苷酸多态位点rs7977932与隐睾发病易感性之间没有发现显著的相关性，但这一观察结果可能是由于本研究中样本有限所致。因此，本实验不能得出rs7977932的SNPs与隐睾发病易感性不相关的结论，同时也应该在更大的研究样本中进一步验证本实验结果的可靠性。我们的研究结果为炎症相关因子IL-31基因多态性与隐睾的易感性的相关性提供了证据。

IL-31的基因多态性或血清表达水平已经被用来确定多种疾病的易感性、预后或转归[15,26,27]。本研究探讨了IL-31基因在隐睾发病中的潜在作用，并成功地确定了IL-31基因SNP与隐睾发病易感性之间的相关性。IL-31基因SNP等位基因和基因型频率在隐睾患者与对照组之间也有显着性差异。提示rs4758680位点的C等位基因可能是主要的易感因素。此外，rs4758680位点的A等位基因携带者(C/A-A/A基因型)可作为中国人群隐睾的一种新的保护因素。