NLRP3 mRNA表达水平与急性酒精性肝炎的相关性*

邢竹韵 吴亚云 王欢 钟朕 申晓旭 袁春艳

(贵州医科大学附属医院感染科，贵州 贵阳 550004)

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)是我国常见肝病，患病率约为1.5%～2.3%，长期大量饮酒是AH的主要病因[1-2]。患者在大量饮酒后突然出现肝细胞大量坏死病理综合征及一系列急性肝功能失代偿症状表现为急性AH[3]，若发展为肝衰竭甚至肝性脑病可称为急性重症AH[4]。目前认为AH的发病机制是乙醇及乙醛代谢产物的肝脏毒素作用，在肝脏内代谢引起肝细胞功能严重紊乱，并诱导肝脏炎症反应、氧化应激、免疫损伤[5]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptors family pyrin domain containing 3，NLRP3)是核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs)家族的成员之一，定位于胞质但可以识别胞内外信号，其中以NLRP3为核心的NLRP3炎性小体在炎症反应免疫调节中起到重要作用[6-7]，NLRP3相关研究也是近年来的研究热点。有研究发现[8-9]NLRP3炎性小体与AH具有关联，在AH急性发病患者中可见血清NLRP3炎性小体水平上升，加重肝脏炎症反应。NLRP3基因的信使核糖核酸(mRNA)携带遗传信息指导NLRP3炎性小体蛋白表达，但未有研究深入分析NLRP3 mRNA是否参与AH发生发展，NLRP3 mRNA在AH发病机制中具有的作用仍不明确。因此，本研究探讨了NLRP3 mRNA表达水平与AH的相关性，并分析NLRP3 mRNA参与AH的作用机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月～2020年10月我院收治的82例AH患者(AH组)。纳入标准：①符合急性AH的诊断标准[10]，定义为大量饮酒后突然出现肝细胞大量坏死和急性肝功能失代偿；根据国外相关指南[11-12]将急性重症AH定义为Maddrey′s判别评分>32分或终未期肝病模型评分>20分，当血清总胆红素>171 μmol/L并且凝血酶原活动度≤40%伴有明显出血倾向时可诊断急性重症AH肝衰竭。②男性。③近期1周内大量饮酒急性发病，日均饮酒≥80 g。④首次急性发病于我院就诊，无既往病史，参与本研究所有检验项目前未接受治疗。排除标准：①合并甲肝、乙肝等肝炎病毒感染。②继发肝癌。③合并严重心脑血管疾病、肾功能不全、血液、免疫疾病。④合并其他原因引起的全身炎症。⑤自身免疫性肝病。⑥药物性肝炎。根据AH病情严重程度分为重症AH组20例、轻症AH组62例。选取同期收治的46例酒精性脂肪肝患者(脂肪肝组)以及30例健康体检者(健康对照组)。本研究获得医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血常规 抽取患者肘静脉血5 mL，采用BC-5500五分类血细胞分析仪(迈瑞生物医疗有限公司)检测中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒/淋巴细胞比值(NLR)。

1.2.2 血生化 抽取患者肘静脉血5 mL，3000 rpm转速下分离血清。采用AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)，根据分光光度法的原理检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)，试剂盒均购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；根据免疫比浊法的原理检测血清白蛋白，试剂盒购自美国伯腾公司。根据胆红素氧化酶法的原理检测血清总胆红素，试剂盒购自北京森美希克玛生物有限公司。

1.2.3 NLRP3 mRNA ①抽取患者肘静脉血5 mL(乙二胺四乙酸抗凝)，先分离单个核细胞，步骤为将1 mL全血加入2 mL离心管中，再加入等体积的外周血单个核细胞分离液液，混匀5 min，在室温下以3500 rpm转速离心10 min，弃上清液。37℃水浴60 min，加入蛋白酶K 3 μL混匀，55℃水浴箱温育过夜，使细胞沉淀溶解。室温下加入等体积的饱和酚，然后在4℃下以5000 rpm转速离心10 min，使用移液器取上清液转移至另一灭菌管中。再加入等体积的氯仿异戊醇，混匀后在4℃ 下以5000 rpm转速离心10 min，使用移液器取上清液，转移至另一灭菌管中。加入总RNA抽提试剂(Trizol试剂)抽提细胞总RNA，干燥RNA沉淀物，保存于-20℃待检。②荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)：NLRP3 mRNA引物为生工生物工程(上海)有限公司负责设计，上游引物5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物5′-GC TTCAGTCCCACACAGA-3′。仪器设备包括PCR扩增仪(美国BioRad公司)、qRT-PCR试剂盒。qRT-PCR反应体系：10×扩增缓冲液10 μL，4种dNTP混合物100 μmol/L，引物5 μmol/L，模板DNA 0.5 μg，Taq DNA聚合酶10 U，MgCl2缓冲液1 mmol/L，双蒸水100 μL。qRT-PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 15 s循环30次，72℃延伸 10 min，最后4℃冷却结束。参照qRT-PCR的说明书，采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 3组患者一般资料比较 3组患者的年龄、体质指数比较无统计学差异(P>0.05)。AH组的日均饮酒量大于脂肪肝组、健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3组患者一般资料比较Table 1 Comparison of general information of patients in the three groups

2.2 3组患者血常规及血生化指标比较 AH组的中性粒细胞计数、NLR比值高于脂肪肝组、健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。3组患者淋巴细胞计数比较无统计学差异(P>0.05)。AH组的血清AST、血清ALT、AST/ALT比值、血清白蛋白、血清总胆红素、血清ALP水平高于脂肪肝组、健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 3组患者血常规及血生化指标比较Table 2 Comparison of blood routine and blood biochemical indexes of patients in the three groups

2.3 3组患者NLRP3 mRNA比较 AH组的NLRP3 mRNA水平高于脂肪肝组、健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 3组患者NLRP3 mRNA比较Table 3 Comparison of NLRP3 mRNA in the three groups

2.4 轻症、重症AH患者NLRP3 mRNA比较 重症AH组的NLRP3 mRNA水平高于轻症AH组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 酒精性AH轻症、重症患者NLRP3 mRNA比较Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA between mild and severe alcoholic AH

2.5 AH患者NLRP3 mRNA水平的相关性分析 AH病情程度与NLRP3 mRNA水平呈正相关(r=0.633，P<0.05)，NLRP3 mRNA水平越高AH患者的病情越严重。中性粒细胞计数、NLR比值、AST/ALT比值与NLRP3 mRNA水平呈正相关(r=0.392，r=0.337，r=0.252，P<0.05)，见表5。

表5 AH患者NLRP3 mRNA水平的相关性Table 5 Correlation of NLRP3 mRNA levels in AH patients

2.6 NLRP3 mRNA鉴别诊断AH以及评估AH病情程度的ROC曲线分析 ROC曲线可知(图1)，AUC面积为0.916，当NLRP3 mRNA水平的最佳截断值为1.62时，NLRP3 mRNA鉴别诊断AH的灵敏度为91.46%，特异度为77.63%。ROC曲线可知(图2)，AUC面积为0.827，当NLRP3 mRNA水平的最佳截断值为1.90时，NLRP3 mRNA评估AH病情程度的灵敏度为90.00%，特异度为72.58%，见表6。

图1 NLRP3 mRNA鉴别诊断AHFigure 1 Differential diagnosis of NLRP3 mRNA for AH

图2 NLRP3 mRNA评估AH病情程度Figure 2 NLRP3 mRNA to assess the severity of AH

表6 ROC曲线分析下的灵敏度、特异度Table 6 Sensitivity and specificity under ROC curve analysis

3 讨论

AH的病理机制较为复杂，酒精及其代谢产物对肝实质细胞产生各种影响，包括氧化应激、无菌性炎症反应、蛋白酶体功能改变等[13]。酒精暴露直接造成肝窦内皮细胞结构的完整性被破坏，肝细胞死亡，激活炎症因子，加重了肝脏炎症反应。有研究表示[14]重症AH以及肝衰竭患者中全身炎症反应综合征和脓毒血症的死亡率增加了3倍以上。随着AH进展为肝纤维化，肝脏星状细胞外出现基质蛋白质沉积，肝脏巨噬细胞参与免疫调节，释放各种炎症介质如肿瘤坏死因子α，还有激活氧化应激反应，产生超氧化物、羟基自由基等活性氧簇，破坏肝脏细胞的动态平衡，诱导肝脏细胞凋亡坏死[15]。传统的炎症指标如中性粒细胞以及肝功能生化指标可用来评估诊断AH，具有一定的临床应用价值，但特异性较差，易出现误诊。本研究显示，AH组的中性粒细胞计数、NLR比值高于脂肪肝组、健康对照组；AH组的血清AST、血清ALT、AST/ALT比值、血清白蛋白、血清总胆红素、血清ALP水平高于脂肪肝组、健康对照组。上述与董德嘉等[16]研究报道相似，在AH初期中性粒细胞计数略微升高，淋巴细胞正常或略微下降，故NLR比值通常会上升。AST/ALT是检测肝功能的常规指标，直接反映肝细胞损伤情况，不同阶段AST/ALT比值存在不同，在AH初期肝脏细胞胞浆、线粒体中的酶大量进入血液，且以AST较多，故血清AST升高幅度通常高于ALT[17-18]。

AH的炎症免疫机制是近年来的研究热点，炎症反应在AH中的作用机制越来越受到临床重视，NLRP3在AH以及非AH肝炎、纳米颗粒性肝损伤等肝脏疾病中的潜在作用引起了临床医生和研究人员的广泛关注[19]。NLRP3炎性小体是炎症反应通道的重要介质，具有特殊的作用，它通常在正常细胞中处于失活状态[20]，当细胞受到氧化应激时NLRP3炎性小体被激活，并进一步活化白细胞介素等多种炎症因子，若NLRP3炎性小体产生过多，加重了组织炎症损伤，会导致肝脏靶细胞出现瀑布样损害，甚至出现全身炎症反应综合征[21-22]。NLRP3炎症小体是固有免疫中关键的胞质内感受器，通过感受不同的病原微生物或危险信号激活多种炎性因子的分泌并诱导细胞凋亡[23]，有研究[24]揭示了ABRO1介导BRISC复合体调控NLRP3去泛素化及活化的分子机制；也有研究指出[25-26]NLRP3炎性小体的激活依靠caspase-1及白细胞介素IL-1和IL-18炎症介质系统。NLRP3炎性小体的不同寻常之处在于它可以由AH许多不同类型的刺激激活，但与AH其他分子上的相关性及相互作用仍不明确。本研究从分子生物学的角度探讨NLRP3 mRNA与AH的关联，结果发现AH组的NLRP3 mRNA水平高于脂肪肝组、健康对照组；并且重症AH组的NLRP3 mRNA水平高于轻症AH组；AH病情程度与NLRP3 mRNA水平呈正相关(r=0.633)，上述提示NLRP3 mRNA水平与AH的发生发展、病情严重程度具有密切关联，这与张龙玉等[27]研究结论相似，该研究报道AH和AH肝硬化患者肝组织中的NLRP3 mRNA水平显著高于正常组，这说明NLRP3 mRNA表达上调调控AH的发病。另外，本研究发现中性粒细胞计数、NLR比值、AST/ALT比值与NLRP3 mRNA水平呈正相关，也间接证实NLRP3 mRNA水平与肝功能损伤严重程度具有正相关关联。

有研究[28]采用肝细胞重组实验分析NLRP3激活AH炎症反应的分子机制，发现在肝脏巨噬细胞中有一个共同的触发信号，即高尔基反面网络结构与NLRP3 mRNA上的多碱基区域相结合，诱导适配体蛋白聚合，从而激活了下游信号级联，这也展示出高尔基体除了加工包装蛋白质的基本功能，还在炎症信号通路中具有特殊作用。对于NLRP3 mRNA在临床上的应用价值，本研究ROC曲线显示NLRP3 mRNA鉴别诊断AH的灵敏度为91.46%，特异度为77.63%；NLRP3 mRNA评估AH病情程度的灵敏度为90.00%，特异度为72.58%，均具有良好的灵敏度与特异度，对于AH患者检测外周血NLRP3 mRNA水平可以预测病情严重程度，为患者预后提供参考。

4 结论

NLRP3 mRNA水平与急性酒精性肝炎的发生发展、病情严重程度具有密切关联，发病机制可能与NLRP3 mRNA表达上调有关，NLRP3 mRNA对酒精性肝炎的病情严重程度具有一定的辅助诊断评估价值，临床应用价值高。但本研究仍具有一定不足，如样本量较少，病例均为男性，今后研究需要开展多中心研究以及体外实验，进一步深入分析NLRP3 mRNA影响AH的机制，为AH疾病的靶向治疗提供新的思路。