奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物在原发性肝癌小鼠中的作用机制及对瘤体体积的影响*

张月凡 张游 胡家骏 黄文秋 王静波

(1.航天中心医院，北京 100049；2.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都610072)

原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)致死率较高，死亡率占全球疾病死亡人数的43%，严重威胁人类生命和健康[1]。癌症的侵袭转移过程十分复杂，与各种黏附相关分子、细胞因子、调节因子、信号转导通路密切相关[2]。研究发现，肝癌β-catenin的异常改变与Wnt信号激活有极大关系，Wnt与关联受体互相作用，使无法被水解的β-catenin与目的基因在细胞核中结合，因此β-catenin水平上升。随着对β-catenin的深入研究，发现β-catenin在肝癌增值、转移过程中扮演重要角色[3]。临床肝癌治疗药物以2价的奥沙利铂(Ⅱ)最为常见，但与其他铂药相同，存在毒副作用大、靶向治疗效果较差、有效药物吸收浓度低等不确定因素。近年来，4价奥沙利铂(Ⅳ)纳米胶束 M(Pt)药物，因其可降解、毒副作用小在临床得到广泛应用[4-5]。但其具体作用机制的研究还处于起步阶段，4价奥沙利铂(Ⅳ)通过阻断wnt1、β-catenin信号的激活能否作为肝癌的治疗策略还有待考察[6]。由此，本文通过建立分组进行实验，探讨奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物在原发性肝癌小鼠中的作用机制及对瘤体体积的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 Trizol试剂(浙江AMEKO)，逆转录试剂盒(武汉 赛维尔)，RT-PCR试剂盒(上海 优予)，RPMI-1640培养基(上海 博升)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海 抚生实业)，腹水型H22肝癌细胞(上海 奥陆生物)，40只雄性昆明小鼠(长沙 天勤生物)，体重(19.15±2.12)g。

1.2 模型制备 选取40只小鼠用于建立原发性肝癌模型，于小鼠左叶肝脏接种浓度为2×107/mL的H22肝癌细胞悬液0.05 mL，正常饲养1周后，选取30只模型小鼠分Ha组(原发性肝癌模型+奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物)、Hb组(原发性肝癌模型+奥沙利铂(Ⅱ)、Hc组(原发性肝癌模型+生理盐水)，Ha组小鼠与尾静脉注射奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物5 mg/kg隔天给药，Hb组注射同等剂量奥沙利铂(Ⅱ)，Hc组注射生理盐水。

1.3 肿瘤体积计算 2周后麻醉，打开小鼠腹腔，取完整的肝组织后断髓处死，检查发现左肝叶凹凸不平，可明显见到肿瘤生成，小鼠造模成功率95%(38/40)，缝合腹部切口，实验在无菌环境下进行。原位肝癌肿瘤组织完整剥除，采用肿瘤的体积测量公式:长×宽2×0.5[1]，电脑测算出每组肝脏肿瘤的体积，取平均值，实验在无菌环境下进行。

1.4 HE染色 小鼠肝组织利用甲醛溶液固定，乙醇溶液脱水，5 μm连续切片，苏木精和伊红染色液复染分别为6～8 min和10s，与显微镜下观察肝组织形态，对肝脏病变程度进行观测，将剩余肝组织保存在-80℃下封存，以便后续实验中提取蛋白。

1.5 RT-PCR检测肝组织wnt1、β-catenin水平变化 将胰蛋白酶加入小鼠肝组织中进行消化反应，进行PBS冲洗，然后滴入0.9%Nacl溶液，总RNA采用rizol法来提取，总RNA提取反转录成 cDNA，按全说明书进行实验，用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对wnt1、β-catenin表达水平进行检测，内参采用GAPDH，60℃，10 min、95℃、72℃，各 30 s 、95℃ 5 min，循环次数以40为准，实验次数至少3次，用相对定量2-ΔΔCT计算wnt1、β-catenin表达，见表1。

1.6 Westernblot法检测肝组织wnt1、β-catenin蛋白表达 在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液，再注入2 mL的培养基，将转染后的细胞放入EP管中,并与胰蛋白酶提取液按照1∶100进行混合,再放入冰箱中冷冻10分钟，使细胞完全裂变，成为E溶液;再EP管中按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2mL，使细胞完全裂变成为F溶液，把E和F溶液以80∶1的体积进行摇匀，配制成工作液，放入37.5℃的保温箱中20分钟，冷却后计算wnt1、β-catenin蛋白浓度。

1.7 流式细胞术检测肝组织细胞调亡情况 取小鼠肝组织乙醇溶液固定，剪碎后置于100目的网上轻搓，PSB冲洗后收集冲洗液，300目尼龙网过滤，收集悬浮液，置于离心机中，600 rpm离心8 min，除去上清液，制成细胞悬浮液，缓冲后加入5μL的碘化丙啶、V-FITC，无光条件孵育20 min，经过滤后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 瘤体体积变化 与Hc组瘤体积对比，Hb组有所下降，与Hb组对比，Ha组瘤体体积明显下降，瘤体积从高到低依次为Hc组、Hb组、Ha组(P<0.05)，见图1。

图1 瘤体体积变化Figure 1 Changes in tumor volume注：与Ha组对比，①P<0.05；与Hb组对比，②P<0.05

2.2 HE染色 Hc组组织中出现大量肿瘤坏死区域，纤维增生明显，细胞核呈分裂状态，Hb组纤维增生状态、坏死区域、细胞核分裂情况好于Hc组，Ha组纤维增生明显减少，肝组织病理改变情况好于Hb组、Hc组，见图2。

图2 HE染色(200×)Figure 2 HE staining

2.3 RT-PCR检测肝组织wnt1、β-catenin水平变化 RT-PCR检测显示：与Hc组对比，Hb组小鼠wnt1、β-catenin水平下降明显，与Hb组对比，Ha组小鼠wnt1、β-catenin水平有所下降，Hc组wnt1、β-catenin水平最高，Hb组其次，Hc组最低(P<0.05)，见图3。

图3 肝组织wnt1、β-catenin水平变化Figure 3 Changes of wNT1 and -catenin levels in liver tissues注：与Ha组对比，①P<0.05；与Hb组对比，②P<0.05

2.4 Westernblot法检测肝组织wnt1、β-catenin蛋白表达 Westernblot法检测显示：与Hc组对比，Hb组小鼠wnt1、β-catenin蛋白表达下降明显，与Hb组对比，Ha组小鼠wnt1、β-catenin蛋白表达有所下降，Hc组wnt1、β-catenin蛋白表达最高，Hb组其次，Ha组最低(P<0.05)，见图4。

图4 3组大鼠肝组织wnt1、β-catenin蛋白表达Figure 4 Expression of wNT1 and -catenin protein in liver tissues of rats in the three groups注：A.三组wnt1、β-catenin蛋白表达；B.三组wnt1、β-catenin蛋白表达比较。与Ha组对比，①P<0.05；与Hb组对比，②P<0.05

2.5 流式细胞术检测肝组织中的肝细胞调亡情况 流式细胞术检测显示：与Ha组对比，Hb组小鼠肝细胞凋亡率降低，与Hb组对比，Hc组小鼠肝组织细胞凋亡率有所下降，Hc组小鼠肝细胞凋亡率最高，Hb组其次，Hc组最低(P<0.05)，见图5。

图5 3组大鼠肝组织中干细胞凋亡情况Figure 5 Apoptosis of stem cells in liver tissues of rats in the three groups注：A.肝组织中的肝细胞调亡情况；B.肝组织中的肝细胞调亡情况比对。与Ha组对比，①P<0.05；与Hb组对比，②P<0.05

3 讨论

多年来，肝癌治疗仍以手术切除最常见，虽然术后进行放疗、化疗生存率有较大的提高，但依旧存在复发和转移的风险[7-8]。近年来有研究报道，Wnt信号通路在细胞增殖，细胞分化和细胞凋亡方面的作用机制[9]。在肝癌中，运用转基因小鼠对Wnt信号通路进行研究，显示Wnt信号通路在肝癌组织中异常激活，并与下游β-catenin产生作用，对肝癌的增值、转移有促进作用[10-12]。近年来，奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物因其具有生物可降解功能、见效快、药效持久、不良反应较少等优点，得到临床工作者的广泛认同[13]。

本研究发现，与Hc组瘤体积对比，Hb组有所下降，与Hb组对比，Hz组瘤体体积明显下降，瘤体积从高到低依次为Hc组、Hb组、Ha组。Hc组组织中出现大量肿瘤坏死区域，纤维增生明显，细胞核呈分裂状态，Hb组纤维增生状态、坏死区域、细胞核分裂情况好于Hc组，Ha组纤维增生明显减少，肝组织病理改变情况好于Hb组、Hc组。相关文献报道，奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物属于抗肿瘤药物，被认定是抗肺癌效果较好的药物，以奥沙利铂(Ⅱ)为基础研制而出，与奥沙利铂(Ⅱ)拥有的抗癌谱类似，但两者中奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物溶解性能、生物利用度偏高[14-15]。奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物可提升肿瘤的免疫原性，促进荷瘤机体中免疫细胞功能的恢复，毒副作用小，同时不易产生耐药性[16-17]。还有研究证实，奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物对癌细胞的作用时间长，抗肿瘤活性能力较紫杉醇高，能杀死组织内的癌细胞，加快药物吸收，在肿瘤细胞侵入其他器官之前将之杀死，从根本上减少了癌症的复发和转移的可能性[18-19]，与本文研究相符。

本研究还发现，Hc组wnt1、β-catenin水平最高，Hb组其次，Ha组最低。与Ha组对比，Hb组小鼠肝细胞凋亡率降低，与Hb组对比，Ha组小鼠肝组织细胞凋亡率有所下降。相关研究证实，调节Wnt信号相关蛋白的活性可以产生“癌基因”作用，而抑制一些肿瘤癌基因的表达，可发挥“抑癌基因”的作用，奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物能有效抑制Wnt/β-catenin 活性[20]。有研究者发现，多数癌症患者机体中β-catenin的表达都有提升，异常表达的Wnt/β-catenin 可加剧机体免疫细胞的损伤。奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物抑制Wnt信号表达后，癌细胞的放射敏感性就会降低，从而提高放疗和化疗的效果[21]。Wnt通路还在众多肿瘤中被发现，例如在胃癌和子宫内膜癌中的异常变化具有重要参考价值，Wnt通路信号被激活时，靶器官的分化受到限制，干细胞特异性被保留，会加快肝癌细胞的分化，导致肿瘤形成[22]。

4 结论

奥沙利铂(Ⅳ)纳米药物对原发性肝癌的疗效好于奥沙利铂(Ⅱ)，能明显缩小肝癌小鼠瘤体积，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin 活性有关系。