血清3-磷酸甘油醛脱氢酶抗体水平在视神经脊髓炎谱系疾病中的变化及其临床意义

张雯，袁婧，魏一鸣，张起尧，郭文治，刘洪波

视神经脊髓炎(NMO)是一种由体液免疫紊乱介导、细胞免疫广泛参与的以视神经和脊髓受累为主的CNS脱髓鞘疾病，通常表现为或同时或分开的视神经炎和急性纵向广泛的横向脊髓炎(LETM)，在亚洲和非洲人中发病率较高[1-3]，复发率及致残率较高，预后不良，多数患者会留有严重的视力损害和肢体功能障碍等后遗症[4-5]。2015年NMO谱系疾病(NMOSD)的国际诊断标准被正式提出，血清水通道蛋白4(AQP4)抗体在诊断NMOSD中高度特异性，但在临床工作中即使是最好的测试也只有不超过80%的敏感性，甚至在一些少数民族中敏感性更低[1,6]。

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解过程中的关键酶，GAPDH基因作为管家基因在同种细胞或组织中的蛋白质表达量一般被认为是恒定的，所以GAPDH蛋白常被人作为细胞质蛋白的标准化内参，近年来有学者对其作为标准化内参的作用提出质疑，指出在各种刺激条件下GAPDH 的mRNA 水平和细胞内的蛋白定位都会发生变化[4,7]，GAPDH反应性抗体可作为神经系统疾病的生物标志物[8-11]，但是GAPDH抗体在神经系统疾病中的具体作用仍不明确。本研究通过检测NMOSD患者外周血中GAPDH反应性抗体的水平，探讨 GAPDH反应性抗体与NMOSD分期、分型和临床特点之间的关系,从分子免疫角度进一步探讨NMO的免疫学发病机制，为NMO的诊疗工作提供依据，为探索新的免疫治疗靶点提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)NMOSD组：选取2017年7月至2018年2月郑州大学第一附属医院神经内科收治的NMOSD患者(包括新发和复发)。所有NMOSD患者均经过2名以上神经内科专家的诊断，诊断均符合2015年NMOSD诊断标准国际共识，且需满足入组标准和排除标准(见表1、表2)，共入组28例。分别采集急性期(起病2周内)和缓解期(起病30～60 d)患者清晨空腹状态下静脉血标本。NMOSD急性期患者抽血前2周内无免疫药物应用及糖皮质激素治疗史。(2)正常对照组：选取医院同期健康体检的健康志愿者14名。

表1 AQP4(+)和AQP4(-)的NMOSD诊断标准诊断标准AQP4(+)AQP4(-)1检测AQP4抗体(CBA法)11/2817/282核心临床特征∗11/1117/17 (1)急性视神经炎6/1111/17 ①头颅MRI正常或仅有非特异性白质病变2/60/11 ②视神经MRI长T2信号或增强的T1信号>1/2视神经长度,或病变累及视交叉4/611/11 (2)急性脊髓炎(MRI长脊髓病变≥3连续椎体节段)9/1113/17 (3)极后区综合征2/113/17 (4)急性脑干综合征5/114/17 (5)其他脑干综合征0/111/17 (6)症状性发作性睡病、间脑综合征,头颅MRI有NMOSD型间脑病变0/111/17 (7)大脑综合征伴有NMOSD型大脑病变0/111/173排除其他诊断11/1117/17 注:∗AQP4-IgG阳性NMOSD诊断至少1项核心临床特征;AQP4-IgG阴性的NMOSD诊断在1次或数次临床发作中至少有2个核心临床症状

表2 NMOSD患者入组标准和排除标准入组标准排除标准标准1 2015年诊断标准多发性硬化(MS)、吉兰-巴雷综合征、Ⅰ型糖尿病等标准2 临床复发定义:新出现的神经系统症状和体征或原有症状加重,持续时间超过24h,在MRI上有对应的新病灶,2次临床发作必须间隔1个月以上妊娠期和哺乳期女性;伴有严重循环系统、呼吸系统、消化系统、血液系统及内分泌系统疾病的患者标准3 临床缓解期:自上次复发时间超过1个月,且未出现新的神经系统症状和体征或原有症状加重伴有恶性肿瘤的患者;伴有严重感染和精神疾病的患者

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂 人GAPDH抗体ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。采用WE scanmk-2全自动酶免仪(芬兰生产),微量加样器，EP管，离心机，水浴锅

1.2.2 患者神经功能评价 根据进行扩展残疾状态量表(EDSS)来判断神经功能缺损程度。

1.2.3 ELISA法检测GAPDH抗体 采用ELISA法，GAPDH抗原包被于微孔板上，标本和标准品中的GAPDH抗体会与抗原结合，未结合物将被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，与结合在抗原上的人GAPDH抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，多余的抗体会被洗去。彻底洗涤后加入底物TMB显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的人GAPDH抗体水平呈正相关，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)。人GAPDH抗体浓度与OD值之间呈正比，可通过绘制标准曲线求出标本中GAPDH抗体浓度。灵敏度20 pg/ml，板内、板间变异系数分别<10%、<15%。

2 结 果

2.1 NMOSD组与正常对照组的人口学特征 (1)NMOSD 组患者共28例，其中男9例，年龄10～73岁，平均(37.00±6.43)岁；女19例，年龄18～74岁，平均(50.21±3.12)岁；急性期18例，平均年龄(41.94±15.89)岁；缓解期10例，平均年龄(53.20±15.86)岁。(2)正常对照组共14名，其中男4名，年龄25～58岁，平均(45.00±12.79)岁；女10名，年龄10～88岁,平均(41.87±21.31)岁。

2.2 NMOSD组和正常对照组中血清GAPDH抗体水平的比较 NMOSD 组中血清GAPDH抗体水平[(52.48±12.07)pg/ml]较正常对照组[(45.65±2.51)pg/ml]明显升高(P<0.05)。

2.3 急性期组、缓解期组和正常对照组中血清GAPDH抗体水平的比较 GAPDH抗体水平在急性期组[(55.99±13.79)pg/ml]较缓解期组[(46.15±2.88)pg/ml]明显升高(P<0.05)；急性期组较正常对照组(45.65±2.51)pg/ml]明显升高(P<0.01)；缓解期组与正常对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 AQP4-IgG(+)组、AQP4-IgG(-)组和正常对照组血清GAPDH抗体水平的比较 血清GAPDH抗体水平在AQP4-IgG(+)组[(54.29±14.01)pg/ml]与AQP4-IgG(-)组[(49.67±8.05)pg/ml]比较差异无统计学意义(P>0.05)；AQP4-IgG(+)组较正常对照组[(45.65±2.51)pg/ml]比较差异无统计学意义(P>0.05)；AQP4-IgG(-)组较正常对照组相比，血清GAPDH抗体水平明显升高(P<0.05)。

2.5 GAPDH抗体水平与年龄、性别和EDSS评分的相关性分析 Spearman相关分析显示，NMOSD患者血清GAPDH抗体水平与年龄、性别和EDSS评分均无关(均P>0.05)。

3 讨 论

近年来人们对GAPDH的分布和功能的研究越来越多，GAPDH是一种在能量产生过程中起关键作用的糖酵解酶，它是一种多功能蛋白，除了具有糖酵解功能外，还具有多种活性。GAPDH作为一种膜蛋白[12-13],具有内吞作用[14]。在细胞质中,参与能量产生、微管蛋白聚合成微管[15]、控制内质网中蛋白质的合成[16];在细胞核中，它参与了细胞核tRNA的输出、DNA复制和DNA修复[17]。有报道[18-19]称抑制GAPDH的糖酵解活性是导致各种形式神经元凋亡的一个重要原因，GAPDH抗体可能诱发了免疫过敏反应，通过激活补体和巨噬细胞，导致神经元和轴突退化。抗体与GAPDH结合也可抑制维持神经元完整性的酶，抑制神经元的糖酵解酶的活性[20]。研究[8]表明GAPDH抗体可能干扰了神经元之间的连接，导致神经系统疾病。

很早就有研究[2,21-22]显示,GAPDH可能作为一种特异性自身免疫性抗原，在MS的发病过程中发挥重要的作用。GAPDH能促使MS患者CNS的B细胞克隆性扩增[3]，MS患者CSF及病变组织的单链可变区基因片段(scFv)抗体均对GAPDH有免疫反应。MS与NMO都是炎性脱髓鞘疾病，有研究[23]表明，NMOSD的外周补体活化明显大于MS，提示NMOSD的外周血中体液免疫较MS明显。本研究发现，NMOSD患者血清GAPDH抗体水平显著高于正常对照组，表明GAPDH抗体在NMOSD的发病机制中扮演了重要的角色。最新研究[8]指出，GAPDH能够与层粘连蛋白结合，层粘连蛋白是细胞外基质的一个组成部分，层粘连蛋白作为细胞分化的粘附底物，在神经可塑性中起着突出的作用。所以GAPDH在NMOSD的发病过程中发挥的作用可能为：GAPDH抗体干扰GAPDH与层粘连蛋白的结合，影响神经元的延展，从而诱导突起退缩，引起轴突脱髓鞘，GAPDH抗体在阻断分子与层粘连蛋白和与CNS中其他粘附和突触分子的结合时，可能改变了神经元的可塑性，并且GAPDH抗体导致神经元生成ATP减少，进而导致神经元变性死亡。另有数据[24-26]显示，GAPDH抗体增加所致GAPDH蛋白聚集，可诱导细胞死亡，导致了病灶内脊髓肿胀、软化、广泛的脱髓鞘，并有坏死、轴突损伤。

有研究[27]表明，系统性红斑狼疮(SLE)伴神经疾病的患者体内的GAPDH抗体水平明显高于SLE患者，SLE伴神经疾病患者的CSF和血清中都存在GAPDH抗体，表明在外周产生的自身抗体通过了通透性改变的血-脑屏障进入CNS，影响了神经元的功能。NMOSD的活动病灶内可见血管周围免疫复合物、补体沉积，所以推测GAPDH的自身免疫反应可能是来自分子模拟。本研究发现，NMOSD急性期患者血清GAPDH抗体水平明显高于缓解期和正常对照组，提示血清GAPDH抗体在NMOSD的急性期起主要作用，所以急性期患者外周血中升高的GAPDH抗体可能是通过受损的血-脑屏障，引起免疫复合物沉积在血管周围，补体激活，B细胞和嗜酸性粒细胞浸润，血管壁逐渐透明样变、增厚、纤维化，待血清GAPDH抗体水平逐渐降低，疾病进入缓解期。缓解期血清GAPDH抗体水平与正常对照组差异无统计学意义，表明血清GAPDH反应性抗体主要在NMOSD的急性期发挥作用，并与NMOSD 的疾病活动性相关。

本研究发现，NMOSD患者外周血中GAPDH抗体的水平与EDSS评分无相关性。神经系统的自身抗体改变神经功能，可能会导致神经精神疾病，范围从轻度认知障碍到严重的情绪损害和精神神经疾病，这取决于抗体的靶点位置和血-脑屏障的渗透区域[28-29]。外周血中GAPDH抗体通过特定受损区域的血-脑屏障进入CNS，即会诱导炎症级联反应的发生，病灶内补体激活、B细胞活化增殖、各种炎症因子浸润，一系列反应致炎性脱髓鞘疾病，推测疾病的严重程度可能与机体的免疫状态有关，认为GAPDH抗体只参与了疾病的发病过程，而在疾病的进展过程中作用甚微。

本研究中，NMOSD患者中AQP4-IgG(-)组与AQP4-IgG(+)组GAPDH水平均有升高，但前者更明显。推测AQP4-IgG(+)患者发病机制中，AQP4-IgG介导的神经损伤占主导地位，而GAPDH抗体的产生是一些次要因素；而在AQP4-IgG(-)的患者发病过程中，GAPDH抗体可能作为一种轴突自身免疫性抗原而发挥作用。本研究中，病例的局限性也可能产生一些影响，具体AQP4-IgG(-)组较AQP4-IgG(+)组GAPDH抗体水平升高更明显的机制仍需要进一步的探索。

有研究[30]称，NMOSD患者首次发病见于各种年龄段，多见于青壮年女性，女性的发病率约为男性的10倍。但本研究中Spearman相关分析显示，NMOSD患者血清GAPDH抗体水平与年龄、性别和EDSS评分均无关。考虑到本研究的样本量较小，还需进一步扩大样本研究证实。

综上所述，血清中的GAPDH抗体参与了NMOSD的发病过程，可反映疾病的活动性，并且与临床分期、AQP4抗体状态相关，而与其年龄、性别和EDSS评分均无关，可能作为NMOSD的生物学标志物。本研究从新的角度研究了NMOSD的发病机制，也为AQP4-IgG(-)的患者提供了新的临床诊疗依据，但仍有待于进一步的深入研究。在此之前，可以考虑将血清中GAPDH反应性抗体的测定作为临床诊断和分期的一种辅助指标。同时也可以开展针对抑制抗GAPDH免疫应答的药物的研究，以期找到更有效的办法降低NMOSD的复发率及致残率，提高NMOSD患者的生活质量。