脑脊液嗜酸性粒细胞比率升高对抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎患者的临床意义

张玉梅，张巧全，余年，张燕芳，宋坤，王娟，朱海青

自身免疫性脑炎(AE)是新近为临床所熟悉认识的一组特殊的由抗神经元抗体所介导的CNS炎症的疾病。抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)抗体阳性脑炎，即抗NMDAR脑炎占所有AE的80%。临床表现为频繁的癫痫发作、认知障碍、精神行为异常、意识障碍、呼吸性低通气等，若得不到及时的诊治，临床死亡率较高[1]。临床工作中，时有发现其CSF中嗜酸性粒细胞(EO)比率升高的案例，其临床意义尚不明确。为此，本研究对我院诊断的抗NMDAR脑炎患者进行分析，探讨其EO比率升高的临床意义。

1 对象与方法

1.1 对象 收集自2016年9月至2020年1月在本院住院或门诊确诊的抗NMDAR脑炎患者。纳入标准：(1)临床症状必须至少有癫痫发作、认知障碍、精神行为异常、意识障碍等四组症状的一组或者多组，或者有头颅影像学显示边缘叶炎性受损的证据。(2)CSF或者血清抗NMDAR抗体阳性，同时进行病毒、细菌、螺旋体等检查，充分排除感染性脑炎；或参照中国AE专家共识(2017版)[2]。(3)患者与家属知晓签署知情同意书，并经本院医学伦理委员会讨论通过。排除标准：(1)未进行规范化免疫治疗；(2)未进行抗神经元抗体系统性自身抗体检测；(3)未进行随访及预后评估；(4)EO增多性脑膜炎；(5)明确为临床中某些特殊药物如青霉素、链霉素、头孢菌素、对氨水杨酸、磺胺、苯妥英钠、氯丙嗪、肝精(肝浸膏)、碘剂、金剂、粒-巨噬细胞集落刺激因子等所致的中度甚至重度EO增多。

1.2 方法

1.2.1 CSF细胞病理学检测和研究分组

1.2.1.1 CSF细胞学制片流程(MGG染色法) 用移液枪吸取CSF标本200 μl，加入细胞离心机(StatSpin Cytofuge 12型)收集器中。1 000 r/min离心3 min取出，自然晾干。滴加MGG染液10 min，流水缓慢冲洗，自然晾干，镜检，分析CSF细胞的分类和计数、百分比，以及是否有异型细胞。

1.2.1.2 分组 根据CSF中EO比率是否升高(>2%)分为EO比率升高组(CSF-EO组)和非EO比率升高组(非CSF-EO组)。

1.2.2 研究指标

1.2.2.1 CSF淋巴细胞亚群分析(免疫细胞染色法) 用移液枪吸取CSF标本200 μl，加入细胞离心机(StatSpin Cytofuge12型)收集器中。1 000 r/min离心3 min取出，自然晾干。将自然晾干玻片经冷丙酮固定5～10 s，取出为免疫标记备用或直接采用SP法(抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司)：一抗(CD20、CD3、CD20、CD45RO)温箱37 ℃孵育2 h，PBS液冲洗，二抗温37 ℃孵育30 min，PBS液冲洗，DAB显色。PBS代替一抗作阴性对照，苏木精复染，封固。免疫组化染色细胞均着色好，易于镜下观察和计数。其中阳性细胞以胞膜、胞质中呈棕色或深棕色标记；计算每个视野阳性细胞百分比，分别计算每个样本5个不同视野的平均值，具体见本课题组的既往研究[3]。

1.2.2.2 病情及预后的评估 所有入组患者统一采用mRS量表于发病14 d内和规范治疗6个月后进行病情及预后的评估[4]。0分：完全无症状；1分：尽管有症状，但无明显功能障碍，能完成所有日常职责和活动；2分：轻度残疾，不能完成病前所有活动，但不需帮助能照料自己的事务；3分：中度残疾，需要一些帮助，但行走不需帮助；4分：中重度残疾，不能独立行走，无他人帮助不能满足自身需要；5分：重度残疾，卧床，失禁，要求持续护理和关注；6分：死亡。

1.2.3 统计学方法 利用SPSS 16.0统计软件进行分析，首先所有入组病例资料进行整理和描述性统计分析，其中年龄、随访时间病程采用为连续性变量，性别、首发症状数、主症数采用计数变量，mRS评分采用等级指标二分类资料进行统计分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料 本组共25例患者。男14例，女11例；14岁以下4例，14～45岁16例，45岁以上5例，年龄最小14岁(男)，最大58岁(女)；平均12.8岁。11例患者头痛明显，24例有发热。其中CSF-EO组7例，一般情况详见表1。与非CSF-EO组相比，CSF-EO组起病较慢，且无前驱感染症状，只有1例有显著精神症状，其余6例患者以意识障碍、癫痫发作、认知功能减退为突出临床表现，且临床多系统损害症状突出(如肺、心脏、关节和皮肤)。CSF-EO组患者和非CSF-EO组在年龄、性别和其他临床症状学分布上均无差异统计学意义(均P>0.05)。

表1 CSF-EO组患者一般情况患者性别年龄过敏史CSF-EO(%)外周血-EO(%)确定合并基础疾病病例1女24无1626特发性EO增多综合征病例2女25无6685慢性嗜酸粒细胞白血病病例3女22无6280嗜酸性肉芽肿性血管炎病例4男45无514长期“湿疹”病史,春秋季节性发作,曾就诊于多地,反复发作病例5女53无616弓形体感染,流浪猫救助,多次流产病例6男56花粉315支气管哮喘病例7男21番茄、芒果312无 注:CSF-EO(%):CSF中EO百分比;同步外周血-EO(%):外周血中EO百分比;嗜酸性肉芽肿性血管炎又称变应性肉芽肿性血管炎,部分文献称为Churg-Strauss综合征

2.2 两组CSF淋巴细胞亚群分析 见表2、图1。CSF-EO组和非CSF-EO组CSF白细胞总数差异无统计学意义，且均表现为淋巴细胞为主。而CSF-EO组的CD20 B细胞比率明显高于非CSF-EO组(P=0.02)。

表2 两组CSF淋巴细胞亚群分析( x±s)CSF-EO组(n=7)非CSF-EO组(n=18)P值白细胞总数(/L)38±29.2728±46.320.60淋巴细胞(%)49±28.5252±39.240.86CD3细胞(%)11±9.4715±7.890.29CD45RO细胞(%)39±25.2441±30.260.88CD20B细胞(%)24±16.5914±2.870.02 注:CD3:成熟T淋巴细胞;CD45RO:活化T细胞标志;CD20:所有成熟的B细胞表面标记物

图1 两组患者CSF MGG染色和淋巴细胞亚群分析(×40)。A和B分别为CSF-EO组和非CSF-EO组的MGG染色，可见CSF-EO组EO比率升高；C和D分别为CSF-EO组和非CSF-EO组的CSF CD3 T淋巴细胞免疫染色；E和F分别为CSF-EO组和非CSF-EO组的CSF CD45RO T淋巴细胞免疫染色；G和H分别为CSF-EO组和非CSF-EO组的CSF CD20 B淋巴细胞免疫染色，其中棕色或深棕色为阳性细胞

2.3 随访预后情况 发病初期(病程<14 d)，CSF-EO组mRS评分[(3.58±2.14)分]和非CSF-EO组[(3.01±2.25)分]差异无统计学差异(P=0.20)；经过规范免疫治疗后，对入组患者进行随访。随访时间为0.6～40个月，中位时间14个月；死亡2例(8%)，均为CSF-EO组患者。整体预后评分CSF-EO组患者mRS评分[(4.48±2.23)分]明显高于非CSF-EO组[(2.96±2.10)分](P=0.04)。

3 讨 论

AE是一组因免疫系统紊乱，由体液免疫或和细胞免疫为主介导的CNS自身免疫性疾病，主要表现有精神症状、认知障碍、运动障碍和癫痫；发病后出现神经功能不全的临床症状，治疗延误或不当，受累神经会因炎性坏死缺血而发生变性纤维化，临床预后较差[5]。然而目前为止，该病的临床发生机制仍然不明，推测可能是在机体一定的遗传易感性背景下，前驱特殊病毒感染和(或)部分患者体内有潜在的恶性肿瘤(如卵巢畸胎瘤和睾丸畸胎瘤)激活机体特定的免疫反应所致[6-7]。然而临床工作中，时有发现抗NMDAR脑炎伴有CSF EO比率升高的患者，目前未见相关研究对其进行探讨。

本研究发现，伴有CSF EO比率升高的抗NMDAR脑炎患者往往缺少前驱感染症状，起病较慢，但临床症状较重，以意识障碍、癫痫发作、认知功能减退为突出临床表现；与非CSF-EO组相比，CSF-EO组精神症状较少，临床多系统损害症状突出(如肺、心脏、关节和皮肤)，总体预后较差。

本研究中4例伴有CSF EO比率升高的抗NMDAR脑炎患者经后续随访证实具有相关基础疾病(特发性EO增多综合征、慢性嗜酸粒细胞白血病、嗜酸性肉芽肿性血管炎、过敏性支气管哮喘)，且这些基础疾病亦会累及神经系统等全身多脏器和系统(如呼吸系统、循环系统、消化系统、皮肤等)，因此症状较重和预后较差，也可能有一部分是这些基础疾病直接参与所致[8]。

当人感染了病毒、细菌、真菌、寄生虫等致病微生物，并侵入脑内不同部位引起CNS感染性疾病，亦可以出现CSF中EO比率升高。临床可以表现为急起的精神行为异常，同时由于皮质海马边缘系统受累，还可出现焦虑、抑郁的神经心理表现，易被误诊和漏诊。然而感染性疾病所致的CSF EO比率升高，伴有白细胞总数的显著升高和其他CSF细胞学变化特点。本研究中病例5虽然既往因多次流产于外院妇产科诊断为“弓形体感染”，但是已经过规范驱虫治疗，且本次入院外周血和CSF弓形体相关检测均为阴性，因此不考虑为弓形体直接感染所致的CNS炎症[9]。该病例抗NMDAR脑炎的发生推测为弓形体感染后继发性获得性机体高免疫反应所致。

本研究进一步证实，与非CSF-EO组相比，CSF-EO组的抗NMDAR脑炎患者CSF中B细胞的百分比显著增加。NMDAR脑炎患者CSF细胞分类中EO或嗜碱性细胞百分比不高，其CD20细胞的百分比就少,AE患者CSF NMDAR抗体滴度水平与CSF中B淋巴细胞具有正相关性，且与患者临床症状严重程度有关[10]。

综上所述，与普通AE相比，伴有CSF EO比率升高的抗NMDAR脑炎患者常缺少前驱感染症状，起病较慢，临床症状较重，精神症状不明显，总体预后较差，可能与其CSF中B淋巴细胞的激活有关。但本研究样本量较少，且入组了CSF中EO百分比>2%的患者，有一定局限性，未来尚需大样本的数据验证结果。